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《河北医科大学》 2011年
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木鳖子醇提物抑制小鼠黑素瘤B16细胞增殖及其机制的实验研究

韩丽娜  
【摘要】:目的:研究木鳖子提取物对肿瘤细胞生长的影响,探讨其抗肿瘤机制;观察木鳖子醇提物(CMSEE)对黑素瘤B16细胞的分化作用,并探讨其对MAPKs相关蛋白的影响;分析木鳖子醇提物CMSEE对小鼠黑素瘤细胞B16及其荷瘤小鼠移植瘤侵袭转移的影响,初步探讨其作用机制,为其作为抗肿瘤新药开发提供参考依据。 方法: 1制备木鳖子提取物:木鳖子醇提物(CMSEE)和水提物(CMSWE);采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)法检测CMSWE和CMSEE对乳腺癌细胞株MDA-MB-231,小鼠黑色素瘤细胞株B16,食管癌细胞株ECa109,人红白血病细胞株K562,肺癌细胞株A549和正常细胞生长的影响,计算细胞生长抑制率,并在光镜下观察细胞形态变化。 2采用克隆集落形成实验检测不同浓度CMSEE(40,20,10μg/ml)作用于B16细胞6 d后,对细胞克隆形成的影响。 3采用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测不同浓度CMSEE(0,40,100μg/ml)作用24 h后,B16细胞周期分布和凋亡率的变化。 4采用MTT方法检测不同浓度CMSEE(10,20,40,100μg/mL)作用于B16细胞24,48,72 h后增殖抑制情况,比色法检测CMSEE对B16细胞黑素生成和酪氨酸酶活性的影响,并采用Giemsa染色技术和电子显微镜观察其形态变化及黑色素小体的形成情况。 5采用免疫印迹技术(western blot)检测MAPKs相关蛋白(t-ERK1/2, p-ERK1/2, t-JNK, p-JNK, t-P38, p-P38)在CMSEE诱导B16细胞分化过程中的作用。 6通过划痕实验和体外迁移实验检测不同质量浓度CMSEE(20,25,30μg/mL)作用24和48 h后,B16细胞侵袭和转移能力的改变。 7分别用RT-PCR和Western印迹法检测不同质量浓度CMSEE(20,25,30μg/mL)作用24 h,以及25μg/mL CMSEE作用不同时间(0,6,12,24,36,48 h)对B16细胞中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9 mRNA及其蛋白表达和基质金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)-1、TIMP-2蛋白表达的影响。 8以B16细胞建立小鼠荷瘤模型,用10 mg/kg CMSEE灌胃治疗荷瘤小鼠,HE染色观察各组小鼠的肿瘤、肝、脾组织的病理变化。 结果: 1木鳖子醇提物(CMSEE)(25-300μg/mL)对B16,A549,ECa109, MDA-MB-231,K562细胞的增殖具有明显的抑制作用(P0.01),并呈剂量依赖性,对正常细胞的生长没有明显影响。CMSWE(25-300μg/mL)对MDA-MB-231,ECa109,A549和K562细胞的增殖没有明显的影响(P0.05),仅对B16细胞的生长有抑制作用,且抑制效果显著低于CMSEE(P0.01)。 2 CMSEE(10,20,40μg/mL)对B16细胞增殖有较强的抑制作用,随着CMSEE作用浓度的增加,克隆数及克隆大小逐渐变小。与对照组相比有统计学差异(P0.05)。 3经不同浓度CMSEE(0,40,100μg/ml)处理24 h后,40μg/ml CMSEE未出现明显的凋亡峰,而100μg/ml CMSEE出现了明显的凋亡峰。细胞周期检测结果显示,随着药物浓度的增大,处于G0/G1期的细胞增多,G2/M期的细胞减少。(P0.05)。 4 CMSEE对B16细胞增殖有较强的抑制作用,随着CMSEE浓度及作用时间的增加,对细胞的抑制率升高。其中100μg/mLCMSEE作用72 h对细胞抑制率最高达70.06%,与对照组相比,不同浓度CMSEE对细胞增殖的抑制率均有显著性差异( P0. 05)。CMSEE作用B16细胞后,细胞表现出典型的分化状态,黑素产生和酪氨酸酶活性增加( P0. 01),细胞呈平行排列,并出现树突状突起,微结构黑色素小体多见。 5 Western blot结果显示,经CMSEE处理后B16细胞中出现P38MAPK的持续磷酸化,伴随着ERK1/2和JNK的脱磷酸化。ERK1/2和JNK特异性的抑制剂增强了CMSEE诱导的B16细胞的分化,而P38MAPK的抑制剂阻碍了CMSEE诱导的B16细胞的分化。结果表明,MAPKs活性的变化与CMSEE诱导的黑素瘤B16细胞分化有关。 6 CMSEE(20~30μg/mL)可明显抑制B16细胞的侵袭和转移能力,可使B16细胞划痕的直径明显变宽(P0.05),穿过Transwell小室膜的细胞数显著减少(P0.05),并呈浓度依赖性。 7 CMSEE(20~30μg/mL)可明显下调B16细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达(P0.05),并有浓度依赖性;而CMSEE对B16细胞中TIMP-1和TIMP-2蛋白表达无明显影响(P0.05)。 8 CMSEE可有效抑制小鼠体内黑素瘤的侵袭和转移。 结论: 1木鳖子提取物(水提物和醇提物)体外均具有抗肿瘤作用,但是木鳖子醇提物较水提物抗肿瘤的作用更强,尤其对黑素瘤B16细胞抑制作用最明显。 2 CMSEE能诱导B16细胞分化,且作用机制可能与其调节MAPKs通路相关蛋白激酶(P38, ERK1/2, JNK)活性有关。 3 CMSEE在体内外均能明显抑制小鼠B16细胞的侵袭、转移能力,其作用机制可能与其抑制MMP-2和MMP-9表达有关。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285.5

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