蕨麻多酚对心肌细胞缺氧损伤的保护作用及机制研究

【摘要】：目的:研究蕨麻多酚对体外培养心肌细胞缺氧损伤的保护作用及机制。 方法:(1)取新生1-3d的SD大鼠心肌细胞原代培养,采用生化手段检测培养基中乳酸脱氢酶(LDH)活性及MTT法检测不同缺氧时间细胞的存活率,以确定心肌细胞的最佳缺氧时间,建立心肌细胞缺氧损伤模型。(2)将搏动状态良好,生长密度无明显差异的心肌细胞随机分为正常对照组、缺氧损伤模型组、蕨麻多酚高、中、低剂量(0.44mg/ml、0.22mg/ml、0.11mg/ml)干预组(缺氧同时加入蕨麻多酚)、阳性药物复方丹参(3mg/ml)组。缺氧6h后,采用HE染色、PI-Hoechst染色、Dapi染色、流式细胞术及生化指标(LDH、CK)的检测观察不同剂量干预组对心肌细胞缺氧损伤的保护作用。(3)通过检测生化指标(NO、NOS、SOD、MDA)、RT-PCR技术检测各实验组Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2、Bax、P53 mRNA表达差异及Western Blot检测各组Caspase-3、Cyt-c、Bcl-2、Bax、P53蛋白表达差异,探讨其保护作用的可能机制。 结果:1模型建立和药物浓度确定:心肌细胞缺氧损伤0-6h,细胞活性变化幅度最大,单位时间内细胞缺氧损伤程度最大,细胞LDH外漏量最多,确定6h为最佳缺氧时间点(本课题组前期已完成)。MTT法检测确定药物高、中、低浓度分别为0.44mg/ml、0.22mg/ml、0.11mg/ml。 2大鼠原代培养心肌细胞形态学观察:倒置显微镜下,正常培养心肌细胞从第三天起成簇生长,细胞簇数量增多,搏动明显,细胞形状多样化,呈圆形、梭形及锥形,胞浆突起呈枝芽状,向细胞簇周围呈放射状生长,折光性强。缺氧损伤后,搏动明显减弱,胞体折光性下降。 3蕨麻多酚对体外培养大鼠心肌细胞缺氧损伤的保护作用:(1) HE染色:蕨麻多酚和复方丹参均明显改善心肌细胞的缺氧损伤形态、结构。(2)PI- Hoechst染色:蕨麻多酚和复方复方丹参明显改善缺氧损伤所致模型组细胞核浓集或呈分叶、碎片状的形态和结构,并减少红染的坏死细胞数。(3)Dapi染色:蕨麻多酚和复方丹参干预后,缺氧损伤所致心肌细胞形态、结构均明显改善。(4)流式细胞术:蕨麻多酚和复方丹参可明显降低缺氧损伤细胞凋亡的百分率(P0.01)。(5)生化指标:蕨麻多酚各剂量组和复方丹参组可显著降低缺氧损伤心肌细胞LDH、CK的外漏量(P0.01)。 4蕨麻多酚对体外培养大鼠心肌细胞缺氧损伤保护作用的机制研究: (1)生化检测:蕨麻多酚各剂量组和复方丹参组均可显著提高缺氧损伤细胞内SOD活性(P0.01),减少MDA的产生(P0.05);并升高NO含量(P0.01)及NOS水平(P0.01)。 (2)RT-PCR:缺氧损伤模型组Bcl-2 mRNA表达较正常组显著降低(P0.01);与缺氧损伤模型组比较,蕨麻多酚各剂量组和复方丹参组Bcl-2 mRNA表达水平均显著升高(P0.01)。缺氧损伤模型组Caspase-9、Caspase-3、Bax、P53 mRNA较正常对照组表达升高(P0.01);与缺氧损伤模型组相比,蕨麻多酚各剂量组Caspase-9 mRNA (高、中剂量组P0.01;低剂量组P0.05)、Caspase-3、Bax、P53 mRNA (P0.01)表达均降低。 (3)Western blot:缺氧损伤模型组心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平较正常组显著降低(P0.01),Caspase-3、Cyt-c、Bax、P53蛋白表达水平较正常组显著升高(P0.01)。与缺氧损伤模型组比较,蕨麻多酚各剂量组和复方丹参组均可提高缺氧心肌细胞Bcl-2蛋白表达量(P0.01)。蕨麻多酚各剂量组和复方丹参组均可降低Caspase-3、Cyt-c、Bax、P53蛋白表达(P0.01)。 结论:蕨麻多酚能够显著减轻缺氧对体外培养大鼠心肌细胞的损伤,使心肌细胞的结构和功能基本恢复正常。蕨麻多酚对体外培养心肌细胞缺氧损伤具有保护作用。其途径可能涉及:提高机体对氧自由基的清除能力;通过下调P53、Bax和上调Bcl-2水平,改善缺氧后线粒体功能,从而下调Cyt-c水平,减弱Caspases级联反应,抑制心肌细胞的凋亡。