Megsin基因对糖尿病小鼠肾组织中ERK5MAPK信号转导通路影响的研究

【摘要】：目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)及其并发症已经成为一个公众健康问题。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一,它已成为终末期肾功能衰竭(end-stage renal failer,ESRF)的主要原因之一。尽管我们对糖尿病肾病做了大量的研究,但是肾脏损伤发生和发展的确切机制目前尚不清楚,因此探索糖尿病肾病的发病机制及防治策略已成为目前广大肾脏病学者迫切关注的课题。 DN是多因素综合作用引起的疾病,目前认为,其发病机制可能与糖代谢紊乱及由此所致的非酶糖基化、蛋白激酶C激活、多元醇通路激活、高血压所致的肾血流动力学改变、脂代谢紊乱、血管活性物质、氧化应激及遗传因素、细胞因子等多因素有关。Megsin基因与蛋白的表达上调在糖尿病肾病发病机制中的作用目前已受到国内学者的关注。Megsin是一种系膜细胞优势表达基因,测试分析显示其属丝氨酸蛋白酶抑制剂(seprin)超家族的一员,特异表达于人、大鼠及小鼠的系膜细胞中,具有重要的功能。其适量的表达对维持人体正常的生理病理过程和体内网络调节平衡是必需的,这些病理生理过程包括凝血、纤维蛋白降解、细胞外基质代谢、细胞分化、增殖与凋亡、发育、血压、肿瘤和炎症等。探讨megsin在糖尿病小鼠的肾组织中作用对于揭示糖尿病肾病的发病机制具有非常重要的意义。故进一步研究megsin与ERK5MAPK之间的相关性在肾病中的作用,也许能为糖尿病肾病的发病机制和防治提供一些实验性的依据。 本课题建立糖尿病小鼠的模型是通过链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导并通过尾静脉质粒注射的方法,将空质粒、megsin质粒及megsin-siRNA质粒经由小鼠尾静脉注入糖尿病小鼠体内,以此分成四组,正常对照组为单侧肾脏切除组,对不同组肾脏病变程度进行观察,并采用免疫组织化学染色和蛋白印迹(western- blot)方法检测不同组megsin、ERK5、TGF-β和FN之间的关系,研究探索megsin参与DN发生和发展的机制,可能为临床治疗糖尿病肾病提供新的干预途径和方法。 方法:选取清洁级健康雄性12周龄CD-1小鼠,共60只,切除单侧肾脏,随机抽取48只腹腔注射STZ(溶于0.1mol/L柠檬酸缓冲液,浓度为2%,pH值为4.5,注射剂量150mg/kg)制备糖尿病小鼠模型,48小时后测定血糖及尿糖,血糖≥16.7mmol/L并且尿糖持续阳性确定为糖尿病小鼠模型,将检测成模的48只糖尿病小鼠随机分为糖尿病组(B组)、糖尿病+空质粒组(C组)、糖尿病+megsin质粒组(D组)和糖尿病+siRNAmegsin质粒组(E组),每组12只,正常对照组(A组)为只做单侧肾脏切除的12只小鼠,采用尾静脉注射的方法导入质粒载体,每周注射1次,,小鼠在整个实验期间自由饮食,不应用胰岛素及其它降糖药物。实验开始后12周末收集尿、血及肾组织标本,检测24小时尿蛋白定量、血肌酐及肾重/体重比值;石蜡切片行HE、PAS和MASSON染色,观察肾小球的病理改变,免疫组化和蛋白印迹(Western-blot)方法检测megsin、ERK5、TGF-β和FN的表达情况,结果用均数±标准差(±s)表示,方差齐性检验用Levene法,统计学处理应用单因素方差分析,组间差异显著性检验采用LSD或Tamhane’s test,显著性水平等于0.05,应用SPSS13.0软件包对所有数据进行统计学处理。 结果:1在注射STZ 4～5天后,B组、C组、D组、E组小鼠出现了多饮、多食、多尿的表现,组间无明显差异,而A组无多饮、多食、多尿出现。在12周末,B组及C组小鼠Scr、KW/BW和UP较A组升高(P0.01),D组升高更明显(P0.01),E组KW/BW和UP较B、C组下降(P0.01)。 2光镜HE显示2周和4周末C组与B组肾小球内系膜细胞增生,基质增多,系膜区增宽,基底膜增厚相比无显著性(P0.05),B组和C组较A组增多,差异有显著性(P0.01),D组增多更显著,差异有显著性(P0.01),12周末B组、C组和D组小鼠系膜细胞增生,基质增多,系膜区增宽,基底膜增厚,高于A组,差异有显著性(p0.01),E组少于同期B组和C组,有显著差异性(p0.05);光镜HE、PAS、MASSON染色显示,第12周末B组和C组肾小球体积增大,系膜细胞增生,基质增多,系膜区增宽,基底膜增厚,E组较B、C组病变减轻,D组病变最严重。 3免疫组化和western blot结果显示:2周末B、C组megsin、ERK5、TGF-β和FN表达增强,D组变化更显著,E组较B、C组表达减弱,组间差异有显著性意义(p0.01);4周末上述各指标变化更为明显,组间比较有显著性差异(p0.01);12周末B、C组ERK5表达水平下降但仍高于A组和E组,弱于D组(p0.01,p0.05),其他指标如megsin、TGF-β和FN表达进一步增强,D组增多更明显,E组表达较B、C减少(p0.01)。 结论:1糖尿病小鼠中megsin和ERK5在肾组织表达增强,推测megsin及ERK5在糖尿病肾病发生发展中起到一定的作用。 2过表达megsin糖尿病小鼠肾脏组织中ERK5MAPK、TGF-β和FN表达明显增强,提示megsin可能与上述因子发挥了协同效应,促进DN的发生与发展。 3通过megsin siRNA质粒转染,megsin的表达受抑制后,ERK5MAPK、TGF-β和FN的表达减少,肾功能受损和肾组织的病变减轻,提示抑制megsin的表达可减轻糖尿病小鼠肾脏损害,为人类早期DN的干预防治提供了新思路。

【关键词】：糖尿病肾病 基因转染 系膜细胞 siRNA megsin ERK5MAPK TGF-β FN
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R587.1
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