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《河北医科大学》 2011年
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MT-3和MT-1E基因转染食管癌细胞株Eca-109对其生长的影响

马国锋  
【摘要】:目的:食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,对人类健康有着严重威胁,世界范围其病死率居恶性肿瘤的第七位[1]。我国是食管癌的高发国家,特别是太行山区为高发地区。探索食管癌的发病机制,进而提出有效的预防和治疗措施,具有深远的理论和临床意义。已有研究表明食管癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多步骤的过程,涉及环境、个人习惯、多种癌基因的激活与抑癌基因的失活以及细胞调控机制异常等多种因素[2,3,4]。 金属硫蛋白(metallothionein, MT)是一类低分子量富含半胱氨酸的金属结合蛋白质。具有清除体内自由基、重金属离子解毒、参与体内微量元素的代谢等作用。MT-3又称神经生长抑制因子(nerve growth inhibitory factor, GIF)具有神经生长抑制活性。有文献报道MT-1和MT-2在食管癌组织中呈高表达状态。而MT-3的研究相对较少。我们的前期研究显示在食管癌组织中存在MT-3基因广泛的超甲基化,而且超甲基化可导致MT-3表达水平的下调。为继续研究MT在食管癌中的作用,本实验采用基因转染、RT-PCR技术,研究MT-3和MT-1E基因在转染食管鳞癌细胞株Eca-109后,表达水平的改变,及对细胞生长的影响。 方法: 1分别取含有EX-T3737-M03-MT-3、EX-T2598-M56-MT-1E及EX-T2598-M56三种质粒的大肠杆菌菌株,前两种质粒分别含有MT-3基因、MT-1E基因,后一种质粒为空载体。大肠杆菌经过夜培养后使用质粒提试剂盒(TIANGEN公司)提取质粒,并测定其浓度与纯度。 2选取食管鳞癌Eca-109细胞株,用RPMI1640培养基在六孔板中进行培养,在细胞汇合达70%后,进行细胞转染。 3应用阳离子脂质体转染法将质粒转染Eca-109细胞,在质粒转染Eca-109细胞48h后,分别收集六孔板中各转染组细胞及空白对照组细胞,进行细胞计数。 4然后提取上述细胞的mRNA,应用RT-PCR法对MT-1E、MT-3的mRNA表达情况进行研究。 5应用SPSS13.0统计软件对所得数据进行分析,统计方法采用方差分析及LSD-t检验,检验标准取a=0.05,以P0.05为差异有统计学意义。 结果: 1三种质粒转染食管鳞癌Eca-109细胞48小时后,在荧光显微镜观察到各转染组均可见荧光标记。EX-T2598-M56-MT-1E质粒与EX-T2598-M56质粒转染的细胞发出红色荧光,转染EX-T3737-M03-MT-3质粒的细胞发出绿色荧光。有荧光标记占细胞总数的80%以上,提示转染成功。 2三组转染组细胞计数均少于空白对照组(P0.05),有统计学意义。转染MT-1E组细胞计数较空载体转染组无明显差异,P0.05,无统计学意义。转染MT-3组细胞计数少于其它三组(P0.05 ),有统计学意义。 3转染MT-1E组MT-1E mRNA表达量大于空载体转染组及空白对照组(P0.05),有统计学意义。空白对照组、空载体转染组、转染MT-3组之间MT-1E mRNA表达量无显著性差异(P0.05),无统计学意义。 4转染MT-3组MT-3 mRNA表达量大于其它三组(P0.05),有统计学意义。空白对照组、空载体转染组、转染MT-1E组之间MT-3 mRNA表达量无显著性差异(P0.05),无统计学意义。 结论: 1 MT-1E、MT-3基因成功的转染Eca-109细胞并进行了基因表达。 2 MT-1E基因转染进入Eca-109细胞并成功表达后,对细胞生长的影响不明显,表明MT-1E基因在食管癌的发病过程中作用不明显。 3 MT-3基因转染进入Eca-109细胞并成功表达后,表现出抑制细胞增殖的作用。提示MT-3基因可以抑制食管癌细胞生长。 4 MT-1E或MT-3基因转染进入Eca-109细胞并成功表达后,并不引起另一种基因表达水平的明显变化,表明一种MT亚型基因的表达不会影响另一种亚型基因的表达,MT各亚型在食管癌组织中的表达可能有各自不同的机制。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R735.1

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【参考文献】
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