收藏本站
《河北医科大学》 2011年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

GAS下调巨噬细胞炎症因子的作用及机制研究

马翠卿  
【摘要】:目的:A族链球菌(GAS,又称为化脓性链球菌)可以引起多种人类疾病,最常见的GAS感染是上呼吸道感染,引发咽炎。尽管咽部感染是自限性的,但如果未彻底治愈,可能发生急性肾小球肾炎、急性风湿热、风湿性心脏病等感染后遗症;有时,GAS感染还会引起严重的侵袭性疾病,如链球菌毒性休克综合症,坏死性筋膜炎等。GAS感染的结果及其严重程度可能依赖于宿主固有免疫机制控制细菌的生长和限制感染部位的病原体进一步扩散的能力。巨噬细胞是启动固有免疫应答的主要力量,并启动稍后的适应性免疫应答。而且,宿主对GAS反应的有关资料也显示在鼠感染模型中定居巨噬细胞在控制GAS感染中发挥着关键作用。巨噬细胞能够识别、吞噬和破坏GAS以清除入侵的病原体,而其产生的细胞因子,趋化因子对于控制感染部位的炎症细胞的招募和活化至关重要。因此,在GAS感染期间巨噬细胞的功能性活化可能大大影响了致病过程的特征、进程和转归。 但是,GAS同时也进化出多种策略以克服宿主的免疫反应。资料显示,一个常见的现象是在严重坏死的GAS感染部位的一线防御细胞数量极少。而且,在体内的感染模型中,GAS的M蛋白是已知的诱导炎症的主要力量,当其及其它毒力因子被单核细胞表面的PRR识别后可以触发多种细胞因子的分泌,包括IL-6,IL-1β,TNF-α,TGF-β等。值得一提的是,产生的细胞因子不但可以诱导炎症可能还会影响链球菌的侵袭等机制。例如,GAS介导产生的TGF-β被发现可以上调整合素α5的表达,即,GAS通过操控宿主细胞因子的产生,提高靶受体的表达水平,进而促进其与宿主细胞的粘附和内化。除此之外,GAS诱导产生的细胞因子还可以通过结合细胞表面的死亡受体诱导巨噬细胞凋亡。这种诱导细胞死亡或凋亡的能力可能对细菌有利,使其逃避吞噬活性或损伤宿主组织,进而促进其向更深部位浸润和播散。 本研究旨在进一步了解有利于GAS适应生存和持续感染状态下的巨噬细胞对GAS的复杂反应,及GAS逃避巨噬细胞攻击的策略,从而进一步探索GAS的致病机制,因此,拟采取以下实验:1、蛋白芯片检测巨噬细胞受GAS感染后其产生的细胞因子的表达谱,利用Real-time PCR验证并动态分析细胞因子的表达,以大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(SA)分别作为G-和G+菌感染巨噬细胞之对照。2、以炎症网络的调节者IL-6为靶点,行In-cell western、ELISA、western blot以了解IL-6的动态变化及其特异性核转录因子亚基C/EBPβ的活化。3、流式细胞术、Real-time PCR、Western blot检测细菌作用下巨噬细胞的TLRs、MyD88、NF-κB,初步了解细菌作用下巨噬细胞活化信号转导通路。4、动物实验验证体内是否与体外细胞水平结果一致。以期为研究GAS的致病机制和免疫治疗提供新视角。 方法: 1蛋白芯片分别检测鼠腹腔巨噬细胞和鼠巨噬细胞RAW264.7受到GAS感染后三天炎症相关因子及趋化因子的表达谱,同时以E.coli和SA分别作为G-和G+菌感染巨噬细胞之对照。 2 Real-time PCR验证GAS/SA/E.coli刺激巨噬细胞后产生的炎症相关因子(如IL-6,IL-1β,TNF-α)和趋化因子(如MCP-1,Rantes,GRO-α)的动态变化。 3 ELISA、in-cell Western检测RAW264.7细胞受到GAS/SA/E.coli感染后产生的主要促炎症因子IL-6的动态变化。 4 RAW264.7细胞、BLAB/c小鼠分别接受GAS/SA/E.coli刺激后三天,流式细胞术分析RAW264. 7细胞和鼠腹腔巨噬细胞膜表面TLR的表达。 5 Real-time PCR检测鼠腹腔巨噬细胞和RAW264.7细胞受到GAS/SA/E.coli刺激后TLR胞内段接头蛋白MyD88的表达差异。 6 Western blot检测RAW264.7细胞受到GAS/SA/E.coli刺激后核转录因子C/EBPβ的表达差异。 结果: 1蛋白芯片结果显示,RAW264.7细胞受到GAS/SA/E.coli感染后3天表达的炎症相关分子中与正常比较表达差异最大的为TNF-α(Ratio:6.07);BLC(Ratio:4.2),IL-1α(Ratio:2.85),Rantes(Ratio:2.68),MCP-1(2.17),LIX (Ratio:1.98),G-CSF(Ratio:1.88),IL-6(Ratio:1.71),M-CSF(Ratio:1.59),及IL-1β(Ratio:1.55)的表达量依次次之。鼠腹腔巨噬细胞受到GAS/SA/E.coli感染后3天的蛋白芯片结果显示与正常比较表达差异最大的为BLC(Ratio:5.0)的表达量最高,KC(Ratio:4.49),IL-1α(Ratio:4.3),TNF-α(2.49),LIX(Ratio:2.25),M-CSF(1.93),IL-1β(1.69),IL-6(1.5)的表达量依次次之; 2 RAW264.7细胞受GAS/SA/E.coli刺激后产生的细胞因子的动态分析显示在2小时之内高表达的主要细胞因子为GRO-α,IL-1β及TNF-α。在2小时候后高表达的主要细胞因子为IL-1β,IL-6,IL-12,MCP-1及IL-10;在对鼠腹腔巨噬细胞受GAS/SA/E.coli刺激后的细胞因子的动态分析显示在2小时内高表达的主要细胞因子为GRO-α,IL-23,TNF-α,Rantes。在2小时后高表达的主要细胞因子为GRO-α,IL-1β,IL-12,MCP-1,MIP-1α。 3无论是鼠腹腔巨噬细胞还是RAW264.7细胞受到GAS刺激后所分泌的细胞因子水平绝大部分较SA和E.coli刺激组低,除了抑制因子IL-10和TGF-β外;其中,在RAW264.7细胞中,IL-10的水平远远高于SA刺激组和E.coli刺激组。而在鼠巨噬细胞中,抑制因子TGF-β的水平占了优势,尽管SA刺激组也表达了高水平的TGF-β。从细胞因子分泌动态角度,无论是鼠腹腔巨噬细胞还是RAW264.7细胞在受到E.coli刺激后产生的细胞因子大多数在1天内达到最高水平;而该细胞受GAS和SA刺激后产生的细胞因子大多数在1天后达到最高水平。 4 TLR受体的表达: 流式细胞术结果及实时定量PCR结果均显示:TLR2:在GAS刺激组和SA刺激组的无论是鼠腹腔巨噬细胞还是RAW264.7细胞表面的TLR2的水平均高于PBS组,且差异具有显著性,而尽管E.coli组的TLR2的水平略高于PBS组,但二者没有显著差异。TLR4:RAW264.7细胞及鼠腹腔巨噬细胞在受到GAS/SA/E.coli刺激后,TLR4的水平均高于PBS组,三组之间无显著差异。 5膜受体接头蛋白MyD88的水平:在感染的2小时内,在鼠腹腔巨噬细胞实验中三组的MyD88的水平均高于PBS组,三组间无显著差异;尽管细菌作用的三组RAW264.7细胞与正常对照组无显著差异。 6核转录因子在细菌作用下的状况: NF-kB:RAW264.7细胞受GAS刺激后,核内的NF-kBp65逐渐增多,而SA刺激该细胞后核内的NF-kBp65始终都处于高水平,但E.coli刺激该细胞后核内的NF-kBp65的水平最低,且逐渐减少。EMSA检测结果显示:GAS刺激组的RAW264.7细胞核内的NF-kB主要在刺激1d后达到高水平状态,而SA刺激后的2h~1d的时段核内的NF-kB都处于高水平状态,尤其是6小时时最明显。E.coli刺激后的RAW264.7细胞核内的NF-kBp65的水平最低,仅在刺激后的2h~6h时检测到少量NF-kB,这与上述的Western blot结果一致。 C/EBPβ:RAW264.7接受菌刺激后,Western blot结果显示G+菌GAS、SA的信号强度高于E.coli及正常对照,这与上述各种方法检测所得G+(包括GAS、SA)诱导该细胞产生较高水平IL-6结果一致。 结论: 1 GAS/SA/E.coli分别诱导RAW264.7细胞和鼠腹腔巨噬细胞产生了不同程度的炎症因子反应。在感染初期巨噬细胞以分泌募集、活化中性粒细胞、诱导产生急性期蛋白为主的炎症因子GRO-α,IL-1β及TNF-α等;在感染三天后以分泌募集、活化巨噬细胞、诱导并维持炎症为主的炎症因子IL-1β,IL-6,IL-12,MCP-1等。 2 GAS在体内外均诱导鼠巨噬细胞产生迟缓而微弱的炎症因子反应;SA诱导RAW264.7细胞产生滞后而强烈的炎症因子反应,但却在体内诱导了一个滞后而较强的炎症因子反应;E.coli无论是在体内还是在体外均诱导鼠巨噬细胞产生迅速而强烈的炎症因子反应,尤其是体内感染时。 3 GAS/SA/E.coli诱导巨噬细胞产生的炎症因子差异与TLR或TLR4的识别有关;E.coli主要诱导TLR4高表达,GAS与SA均可同时诱导TLR2和TLR4的高表达,这可能有利于其与TLR2或TLR4的结合。 4接头蛋白MyD88参与了病原体感染的巨噬细胞的的信号转导过程,但与GAS/SA/E.coli诱导巨噬细胞炎症因子反应的快慢、强弱没有必然联系。可能还存在其他接头蛋白参与调节巨噬细胞反应的信号转导,导致NF-kB转位入核的时间和数量存在差异,这可能是GAS/SA诱导了不同的巨噬细胞反应的原因,而E.coli诱导巨噬细胞产生MIP-1β及TNF-α等为主的炎症因子并不主要依赖核转录因子NF-κB及C/EBPβ的作用。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R363

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 ;[J];;年期
2 ;[J];;年期
3 ;[J];;年期
4 ;[J];;年期
5 ;[J];;年期
6 ;[J];;年期
7 ;[J];;年期
8 ;[J];;年期
9 ;[J];;年期
10 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 柴婵娟;杨志明;康玉明;肖传实;;核因子-κB信号途径介导血管紧张素Ⅱ诱导THP-1巨噬细胞基质金属蛋白酶-9的表达[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年
2 吴南屏;常秀春;姚航平;李丹;冯磊;;RANTES蛋白对SARS病毒感染巨噬细胞的抑制效应及机制[A];2006年浙江省感染病、肝病学术会议论文汇编[C];2006年
3 梁华平;韩健;吴丹;徐祥;王正国;;创伤小鼠腹腔巨噬细胞自噬活性降低[A];全国危重病急救医学学术会议论文汇编[C];2007年
4 尤胜义;寇丽;费乃昕;马春蕾;;重症急性胰腺炎大鼠脾脏巨噬细胞Toll样受体4的表达与内毒素耐受[A];中华医学会第十一届全国胰腺外科学术研讨会论文汇编[C];2006年
5 刘星光;姚鸣;李楠;王春梅;郑媛媛;曹雪涛;;钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ通过结合并活化TAK1和IRF3加强巨噬细胞中TLR配体诱导的炎症因子和Ⅰ型干扰素的产生[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
6 张伟;周寿红;凌宏艳;姚起鑫;亓竹青;胡弼;;槟榔碱抑制氧化性低密度脂蛋白刺激巨噬细胞炎症因子的表达及其机制的初步探讨[A];湖南省生理科学会2008年度学术年会论文摘要汇编[C];2008年
7 陈均法;郑智茵;孔英;郭艳荣;沈建平;叶宝东;林筱洁;高瑞兰;周郁鸿;;硼替佐米对THP-1源性巨噬细胞抗原提呈能力的影响[A];2011年浙江省血液病学术年会暨浙江省医学会血液病学分会成立50周年庆典论文汇编[C];2011年
8 杨晓彤;任文智;马伟超;杨明俊;糜可;冯慧琴;杨庆尧;;云芝糖肽(PSP)对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的双向免疫调节作用[A];中国菌物学会2009学术年会论文摘要集[C];2009年
9 张玲;江远;何金洋;郭兴伯;;铁沉积于巨噬细胞对TGF-β_1、iNOS、TNF-α mRNA表达的影响[A];中华中医药学会全国第十四次肝胆病学术会议论文汇编[C];2010年
10 周勇;夏泠;周亚娟;何忠时;谢丛华;;电离辐射对RAW264.7细胞系MMP-9基因表达的影响[A];湖北省抗癌协会青年委员会成立大会暨第一届青年学术论坛资料汇编[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 兰克;以尝试用巨噬细胞治瘫痪[N];科技日报;2000年
2 实习记者 李文洁;U—GAS技术为云南褐煤开发辟新径[N];中国化工报;2010年
3 唐颖 倪兵 陈代杰;巨噬细胞泡沫化抑制剂研究快步进行[N];中国医药报;2006年
4 张中桥;白藜芦醇可抑制巨噬细胞释放细胞因子[N];中国中医药报;2007年
5 ;以临床实验治疗瘫痪新法[N];中国医药报;2000年
6 侯嘉 何新乡;硒的神奇功能[N];中国食品质量报;2003年
7 卢苏燕;艾滋病毒怎样钻进免疫“肚子”[N];新华每日电讯;2007年
8 卢苏燕;HIV破坏免疫系统机制被揭示[N];医药经济报;2007年
9 本报记者 杨珂;了解我们的体内“卫士”——免疫系统[N];中国消费者报;2001年
10 李东方;咖喱可预防早老性痴呆[N];中国中医药报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 马翠卿;GAS下调巨噬细胞炎症因子的作用及机制研究[D];河北医科大学;2011年
2 章宏;1.人巨噬细胞金属弹性蛋白酶在胃癌细胞及胃癌组织中的表达及临床意义 2.胃癌和结肠癌患者二氢嘧啶脱氢酶基因多态性与5-FU代谢及临床意义探索[D];浙江大学;2006年
3 王玉珍;溶酶体相关的小G蛋白Rab7b负向调节巨噬细胞Toll样受体信号转导的研究[D];浙江大学;2006年
4 杨洋;DcR3干预肺纤维化动物模型及其转染人成纤维细胞的实验研究[D];吉林大学;2009年
5 姜蕾;GAS6参与动脉粥样硬化发病机制的基础与临床研究[D];华中科技大学;2011年
6 鞠瑞;羧胺三唑的抗癌新机制抑制肿瘤相关巨噬细胞中促炎细胞因子的释放[D];北京协和医学院;2011年
7 尚嫄嫄;Tribble3在动脉粥样硬化巨噬细胞凋亡中的作用及其信号转导通路[D];山东大学;2010年
8 朱继峰;IL-7抑制巨噬细胞凋亡的机制研究[D];南京医科大学;2012年
9 熊怡淞;Siglec-1介导巨噬细胞炎症反应在动脉粥样硬化发病中的研究[D];第二军医大学;2011年
10 黄志强;单核细胞衍生的巨噬细胞应用IFN-γ和Lps处理的抗肿瘤实验研究[D];第二军医大学;2001年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 余琦琦;壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究[D];浙江大学;2002年
2 冯洁;壳寡糖与巨噬细胞结合特性的研究[D];浙江大学;2004年
3 田美玉;复发性口腔溃疡粘膜组织中肥大细胞和巨噬细胞的研究[D];山西医科大学;2004年
4 龙飞;糖皮质激素对巨噬细胞快速非基因组作用的研究[D];青岛大学;2005年
5 徐启华;玉屏风散转化液对小鼠相关免疫功能影响的研究[D];黑龙江中医药大学;2005年
6 武多娇;炎症细胞在自发性高血压大鼠心肌纤维化中的作用及苯那普利的干预研究[D];福建医科大学;2005年
7 徐宗华;胸苷磷酸化酶在人脑胶质瘤中的表达、分布及临床意义[D];四川大学;2005年
8 梅智谋;巨噬细胞与血管内皮生长因子在平滑肌肿瘤的表达及意义[D];武汉大学;2005年
9 杨维娜;子宫内膜异位症中单核—巨噬细胞分泌白介素-1α、β和干扰素-γ水平的研究[D];天津医科大学;2006年
10 李永军;糖基化终产物对巨噬细胞MMP-9表达与活性的影响及其机制的初步研究[D];中国医科大学;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026