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《河北医科大学》 2011年
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柴苓汤对环孢素A肾病大鼠a-SMA表达的影响

王香婷  
【摘要】:CsA肾病是以肾间质纤维化为特征的病理改变,表现为炎症细胞浸润,细胞外基质积聚,小管萎缩和管周毛细血管缺失,其发病机制与血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)、内皮素~(-1)(Endothelin~(-1),ET~(-1))、氧化损伤、醛固酮活化等有关,其中细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积是肾小管间质纤维化的重要特征。大量的实验证实在ECM的沉积中,转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)起着重要的作用,证实其介导了肾小球的硬化和肾间质纤维化。在纤维化的进展过程中,有证据显示,肾小管上皮细胞表型转化—肌成纤维细胞转分化(tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation ,TEMT)在肾小管病变、小管间质纤维化的发生、发展中起重要作用,其标志蛋白表达为a-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscular actin,a-SMA)。 CsA慢性肾毒性属中医学“水肿”、“腰痛”、“虚劳”、“淋证”等疾病范畴。药毒伤肾,肝郁气滞,脾肾亏虚,水湿内停是本病的主要病机特点。治疗上应利水泻毒、补益脾肾、疏肝理气。柴苓汤是小柴胡汤与五苓散的合方,两方均出自张仲景的《伤寒杂病论》,由柴胡、黄芩、半夏、人参、甘草、生姜、大枣、猪苓、桂枝、白术、茯苓、泽泻组成,功能利水泻毒、疏肝健脾,与CsA肾病的发病机制和病变位置药证合拍。为研究利水泻毒、疏肝健脾方药治疗CsA肾病的作用机理、探索古方新用,我们采用CsA慢性肾毒性大鼠模型,观察利水泻毒、疏肝健脾中药柴苓汤及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦对环孢素A肾病大鼠TGF-β_1、a-SMA及Ⅲ型胶原(collagen typeⅢ,ColⅢ)表达的影响。研究结果如下: 实验一柴苓汤对环孢素A肾病大鼠肾功能及病理形态学的影响 健康雌性SD大鼠40只,随机分为对照组、模型组、缬沙坦组、柴苓汤组,每组10只。实验动物给予CsA 30mg·kg~(-1)·d~(-1)经口灌服,对照组给予等容量橄榄油,缬沙坦组予缬沙坦10mg·kg~(-1)·d~(-1),柴苓汤组以柴苓汤3g·kg~(-1)·d~(-1)剂量给药,自来水溶解后经口灌胃,共28天。每周末将动物放入代谢笼中,收集24小时尿量,并测体重。所有动物于第29天断头处死,切取肾脏,常规制备血清及肾组织石蜡切片标本,行HE、Masson染色,观察肾组织病理学改变。检测血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)和尿肌酐(Ucr)的含量,计算肌酐清除率。 结果显示:(1)对照组大鼠精神状况、活动、毛发、饮食、饮水、尿量等无明显改变。模型组精神萎靡、活动差、饮食、饮水量下降、毛发变黄、松乱、部分脱落。缬沙坦组一般状况好于模型组。柴苓汤组与缬沙坦组相同。各组大鼠体重在不同时间对比无明显差异(P0.05)。应用CsA 2周后,模型组的尿量(19.650±9.569 ml)比正常对照组(15.650±2.015)略为增多,但各组间相互比较无明显差异。在应用CsA 3周后,模型组尿量(21.450±8.952)明显多于正常对照组(15.400±2.514)(P0.05),但缬沙坦组(17.400±5.854)及柴苓汤组(15.812±7.025)尿量并不增多,和正常对照组比较无显著差异。4周后,模型组尿量(29.150±13.695)明显高于正常对照组(15.800±2.529)及治疗组(16.700±4.939,16.734±6.198)(P0.01)。(2)各组大鼠肾组织病理形态学改变:HE染色显示对照组肾小管上皮细胞排列整齐,无水肿;模型组肾小管上皮细胞坏死、脱落,间质大量炎性细胞浸润;缬沙坦组及柴苓汤组小管上皮细胞水肿、坏死、脱落及炎性细胞浸润均较模型组为轻。Masson染色结果显示对照组未见异常。模型组结构紊乱,小管间质胶原沉积显著增多。柴苓汤组及缬沙坦组小管间质胶原沉积较模型组明显减少。(3)各组大鼠尿素氮、血肌酐、肌酐清除率的变化:模型组大鼠尿素氮(11.395±1.824mmol/L)、血肌酐(99.067±5.426μmol/L)较对照组(6.3450±1.053,79.117±3.511)明显升高( P 0.01 ),肌酐清除率( 0.2823±0.0466ml/min )较对照组(0.5415±0.0257)明显降低(P0.01)。用药后,缬沙坦组及柴苓汤组尿素氮(8.615±0.878,7.160±0.679)、血肌酐(87.817±13.189,82.933±9.239)较模型组均明显降低(P0.01),肌酐清除率(0.3428±0.0624,0.3465±0.0383)较模型组明显升高(P0.05)。 实验二柴苓汤对环孢素A肾病大鼠a-SMA表达的影响 模型复制、分组、给药方法同上,共28天。留取肾脏,采用RT-PCR、Western-Blot、免疫组化、流式细胞术检测大鼠肾脏a-SMA蛋白及mRNA的表达。 结果显示:(1)采用RT-PCR测定a-SMA mRNA表达,结果显示对照组大鼠呈弱表达( 0.9177±0.1239 ),模型组表达明显增强(1.1950±0.0467),与对照组相比有显著差异(P0.01),柴苓汤组(0.9857±0.0760)及缬沙坦组(1.0503±0.1420)较模型组表达明显降低(P0.05)。(2)Western Blot检测肾组织a-SMA蛋白结果显示对照组大鼠肾组织a-SMA蛋白少量表达(0.2766±0.1405),模型组表达显著增强(0.8788±0.3104),与对照组相比差异有显著性(P0.01),柴苓汤组(0.5083±0.1092)及缬沙坦组(0.5467±0.0737)a-SMA的表达较模型组显著降低。(3)肾组织a-SMA免疫组化检测:光镜下对照组仅在血管平滑肌细胞强阳性表达,肾小球、肾小管及间质未见表达;模型组a-SMA表达主要在皮质区及皮髓交界的小管间质区,柴苓汤组及缬沙坦组小管间质区a-SMA表达较模型组明显减少。(4)肾组织a-SMA流式细胞术检测分析结果显示,a-SMA蛋白表达定量荧光指数(FI)模型组(0.9847±0.0065)明显高于对照组(0.8197±0.0064)(P0.01);柴苓汤组(0.9111±0.0068)及缬沙坦组(0.9131±0.0126)蛋白表达定量荧光指数明显低于模型组(P0.01)。 实验三柴苓汤对环孢素A肾病大鼠TGF-β_1表达的影响 模型复制、分组、给药方法同上,共28天。留取肾脏,采用RT-PCR、免疫组化检测大鼠肾脏TGF-β_1蛋白及mRNA的表达。 结果显示:(1)采用RT-PCR检测TGF-β_1 mRNA表达,结果显示对照组大鼠呈弱表达( 0.7927±0.0899 ),模型组表达明显增强(1.1270±0.1239),与对照组相比有显著差异(P0.01),柴苓汤组(0.8683±0.0938)较模型组明显降低(P0.05)。(2)肾组织TGF-β_1免疫组化表达结果显示对照组呈弱表达。模型组表达显著增强,见于肾小管、间质及肾小球处,柴苓汤组及缬沙坦组小管间质区TGF-β_1表达较模型组明显减弱。 实验四柴苓汤对环孢素A肾病大鼠ColⅢ表达的影响 模型复制、分组、给药方法同上,共28天。留取肾脏,采用RT-PCR、Western Blot、免疫组化检测大鼠肾脏ColⅢ蛋白及mRNA的表达。 结果显示:(1)采用RT-PCR检测ColⅢmRNA表达,结果显示对照组大鼠呈弱表达(0.7630±0.0557),模型组表达明显增强(0.9180±0.0593),与对照组相比差异有显著性(P0.05),柴苓汤组(0.8107±0.0761)及缬沙坦组(0.8300±0.0719)表达明显降低。(2)Western Blot检测肾组织ColⅢ蛋白结果显示对照组大鼠肾组织ColⅢ蛋白少量表达(0.2129±0.1089),模型组表达明显增强(0.7334±0.1396),与对照组相比差异有显著性(P0.01),柴苓汤组(0.3337±0.0802)及缬沙坦组(0.4343±0.1997)ColⅢ的表达较模型组显著降低(P0.01,P0.05)。(3)肾组织ColⅢ免疫组化表达结果显示,对照组极少量表达,呈浅黄色。模型组表达显著增加,可见棕黄色甚至呈棕褐色染色,柴苓汤组及缬沙坦组小管间质区ColⅢ表达较模型组明显减弱。 结论: 1柴苓汤对环孢素A肾病大鼠的肾组织结构损伤具有明显的改善作用,可减轻胶原纤维的表达及纤维化程度,降低血肌酐、尿素氮,升高肌酐清除率,改善肾功能。 2柴苓汤可下调CsA所诱导的肾组织a-SMA的高表达,通过抑制肾小管上皮细胞表型转化延缓小管间质纤维化的进程。 3柴苓汤可抑制CsA肾病大鼠肾组织中TGF-β1mRNA及蛋白的表达,从而减少细胞外基质沉积,延缓肾间质纤维化进程。 4柴苓汤可下调CsA肾病大鼠肾组织中ColⅢmRNA及蛋白的表达,抑制胶原沉积,促进胶原降解,拮抗CsA肾病大鼠纤维化,减缓肾病进程。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R285.5

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9 黄燕琛;柴苓汤加减方与肾炎康复片治疗慢性肾小球肾炎湿热证的疗效比较[D];南京中医药大学;2011年
10 郑桂安;阿托伐他汀对SD大鼠系膜增殖性肾炎的影响及其可能机制[D];福建医科大学;2006年
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