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《河北医科大学》 2011年
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和血生络法对实验性心肌梗死大鼠的促血管新生作用及机制研究

侯仙明  
【摘要】:目的: 冠心病是中老年人的常见病和多发病,随着饮食结构等因素的变化,发病年龄日益年轻化,发病人数迅速上升,已成为引起死亡人数最多的十种疾病之一。现代医学虽然对此病有药物、手术、介入等多种疗法,但仍有很多患者不适用于上述疗法或效果不佳,治疗性血管新生疗法的产生为这些患者带来了希望。已有数千年历史的中医药虽然是这一新疗法的践行者,取得了很好的临床疗效,但由于理论认识的差异性,导致中医药疗法不能被广泛接受。我们依据传统中医理论认识,并结合文献及临床研究,提出血脉不和是冠心病的基本病机,以调和血脉为内涵的和血生络法是本病的基本治法。通过建立实验性心肌梗死模型,观察和血生络法对心梗模型血管新生的影响,利用逆转录-聚合酶链反应、蛋白质印迹等现代先进的检测技术观察了bFGF、MMP-2/TIMP-2、G-CSF、AKT、ERK等指标的变化,从生长因子、细胞外基质、内皮祖细胞、信号通路等多方面对促血管新生的机制进行了探讨,为和血生络法广泛应用于临床奠定了坚实的理论基础。 第一部分 中医对冠心病和血管新生的认识及和血生络法的提出 简述了冠心病的概念、表现、分类、治疗原则及常规治疗方法。鉴于冠心病治疗中存在的不足,介绍了本病治疗中的新思路,即治疗性血管新生。对其主要研究概况及应用前景进行了简要归纳。由于治疗性血管新生目前仅限于理论研究和临床前期阶段,并不能实际应用于临床,而中医的“脉络”与现代医学的“血管”对应,血管新生与中医学“生脉”等理论具有高度一致性,这就为重新审视中医药的治疗机制提供了新思路,也为中医药在冠心病的治疗中发挥其良好的作用提供了广阔前景。 整理查阅了大量的古今中医药与冠心病相关的文献,对与冠心病相关的中医病名、临床表现及鉴别进行了整理归纳,同时分析了古今对冠心病病因病机及治疗方法的认识,结合我们的临床体会提出了冠心病的基本病机是血脉失和,而“和血生络法”是冠心病的基本治法。 第二部分 心肌梗死大鼠模型制备及“和血生络法”促血管新生的作用 方法: 健康雄性Wistar大鼠通过结扎冠状动脉左前降支建立实验性心肌梗死动物模型。选取造模成功大鼠48只,按照随机数字表法随机分为模型组(M)、消心痛组(Y)、和血生络低剂量组(D)、和血生络高剂量组(G),每组12只;另设假手术组(J)大鼠12只。术后24h灌胃给药,药物干预3周后,每组取6只大鼠心脏以TTC染色法测定大鼠左室心肌梗死范围;每组取另6只大鼠心脏免疫组化方法检测心肌梗死边缘区CD34表达,检测微血管数量和微血管密度。同时应用HE染色观察梗死边缘区的病理变化。 结果: 1大鼠一般状况的观察比较 大鼠呈蜷缩状态,精神萎靡,活动较少,毛发黄白色枯槁无光泽且多倒竖,进食量明显减少。抓握大鼠时无反抗或反抗较轻。假手术组大鼠手术后1天,食欲和运动量即恢复至术前状态,毛发平滑光泽无枯槁现象。实验进程中,模型组大鼠仍然表现出饮食、活动少的状态,因而出现增重缓慢,甚至无增重的情况。皮毛状态未见明显改观。各用药物组大鼠精神状态逐渐好转,表现出不同程度增重,尤以和血生络大剂量组最为明显。 2心肌梗死范围 假手术组大鼠未出现心肌梗死。模型组大鼠心肌梗死范围为(29.6±1.4)%,和血生络高剂量组、低剂量组及消心痛组大鼠心肌梗死范围分别为(19.5±2.2)%、(22.0±2.3)%、(26.1±2.5)%。各治疗组梗死范围均明显小于模型组(P0.05),和血生络高剂量组、和血生络低剂量组明显优于消心痛组(P0.05),差别具有统计学意义。 3心肌梗死边缘区微血管数量(MVC)和微血管密度(MVD) 假手术组大鼠MVC/MVD为75.50±4.29,模型组大鼠为88.50±2.44,较假手术组大鼠显著增高(P0.05)。和血生络高剂量组、低剂量组及消心痛组大鼠MVC/MVD分别为133.90±6.50、122.03±2.68、117.50±3.68。各治疗组明显高于模型组(P0.05)。和血生络高剂量组明显优于和血生络低剂量组及消心痛组(P0.05)。 4病理组织变化 模型组高倍镜下部分心肌细胞肿胀,间质水肿,梗死灶可见心肌纤维溶解,纤维组织增生、炎细胞浸润。和血生络低剂量组、消心痛组表现为心肌细胞坏死较模型组少见,少量炎细胞浸润,纤维组织增生少见。和血生络高剂量组大多数心肌细胞无异常,个别心肌坏死、炎细胞浸润,无明显纤维增生。假手术组心肌细胞未见明显异常,无纤维组织增生及炎细胞浸润。 第三部分 “和血生络法”对碱性成纤维细胞生长因子的影响 方法: 健康雄性Wistar大鼠通过结扎冠状动脉左前降支建立实验性心肌梗死动物模型。选取造模成功大鼠48只,按照随机数字表法随机分为模型组(M)、消心痛组(Y)、和血生络低剂量组(D)、和血生络高剂量组(G),每组12只;另设假手术组(J)大鼠12只。术后24h灌胃给药,药物干预3周后,每组取6只大鼠心脏免疫组化法检测bFGF在大鼠心梗边缘区中的蛋白表达,用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统分析其平均灰度。每组取6只大鼠心脏组织RT-PCR法检测bFGF mRNA在大鼠左室心肌组织的表达,用法国VL公司BIO-PROFIF凝胶图象分析系统对目的电泳条带进行分析,以相应的内参电泳条带作为参照,结果以两者之积分吸光度的比值表示。每组取8只大鼠的血清ELISA法检测bFGF在血清中的含量。 结果: 1大鼠心梗边缘区bFGF的蛋白表达及其平均灰度 模型组、假手术组平均灰度分别为197.83±5.55、218.20±3.55,模型组bFGF蛋白表达明显高于假手术组(P0.05)。和血生络高剂量组、和血生络低剂量组、消心痛组平均灰度分别为163.02±6.56、174.93±2.66、176.80±3.59,bFGF蛋白表达较模型组明显增高(P0.05)。和血生络高剂量组较和血生络低剂量组与消心痛组表达明显增强(P0.05)。 2 bFGF mRNA在大鼠左室心肌组织的表达及积分吸光度的比值 模型组(0.31±0.01)较假手术组(0.18±0.05)明显增强(P0.05)。和血生络高剂量组(0.69±0.17)、和血生络低剂量组(0.49±0.04)、消心痛组(0.70±0.10)bFGF mRNA表达较模型组明显增强(P0.05)。和血生络高剂量组与消心痛组较和血生络低剂量组表达明显增强(P0.05)。 3 bFGF在血清中的含量 模型组(3.78±0.25)血清中bFGF含量较假手术组(2.99±0.42)增高,但无统计学差异(P0.05)。和血生络低剂量组(4.32±1.29)亦较模型组增高但无统计学差异(P0.05)。和血生络高剂量组(5.29±1.13)、消心痛组(5.04±2.10)较模型组bFGF含量明显增高(P0.05)。 第四部分 “和血生络法”对基质金属蛋白酶-2及基质金属蛋白酶组织抑制剂-2的影响 方法: 健康雄性Wistar大鼠通过结扎冠状动脉左前降支建立实验性心肌梗死动物模型。选取造模成功大鼠48只,按照随机数字表法随机分为模型组(M)、消心痛组(Y)、和血生络低剂量组(D)、和血生络高剂量组(G),每组12只;另设假手术组(J)大鼠12只。术后24h灌胃给药,药物干预3周后,每组取6只大鼠心脏免疫组化法检测MMP-2及TIMP-2在大鼠心梗边缘区中的蛋白表达,用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统分析其平均光密度值。并与bFGF作相关性分析。 结果: 1 MMP-2在大鼠心梗边缘区中的蛋白表达 模型组(0.1490±0.0119)MMP-2蛋白表达较假手术组(0.0688±0.0072)明显增高(P0.05)。和血生络高剂量组(0.2545±0.0161)、和血生络低剂量组(0.2174±0.0116)、消心痛组(0.2204±0.0109)MMP-2蛋白表达较模型组明显增高(P0.05)。和血生络高剂量组强于消心痛组及和血生络低剂量组(P0.05)。 2 TIMP-2在大鼠心梗边缘区中的蛋白表达 模型组(0.1328±0.0104)TIMP-2蛋白表达较假手术组(0.0835±0.0085)明显增高(P0.05)。和血生络高剂量组(0.1878±0.0106)、消心痛组(0.1812±0.0105)较模型组TIMP-2蛋白表明显增高(P0.05)。和血生络低剂量组(0.1690±0.0093)虽从数值看高于模型组,但并无统计学差异(P0.05)。 3 MMP-2与TIMP-2比值变化 模型组(1.12±0.05)MMP-2/TIMP-2较假手术组明(0.82±0.03)显增高(P0.05)。和血生络高剂量组(1.36±0.04)、和血生络低剂量组(1.29±0.04)、消心痛组(1.22±0.04)MMP-2/TIMP-2较模型组明显增高(P0.05)。中药组强于消心痛组且和血生络高剂量组强于和血生络低剂量组(P0.05)。 4 bFGF与MMP-2、MMP-2/TIMP-2的相关性分析 将实验二心肌bFGF蛋白表达与MMP-2、MMP/TIMP的表达进行相关性分析,结果bFGF与MMP-2、MMP/TIMP的表达均呈正相关,r分别为0.967、0.926,P0.01。 第五部分 “和血生络法”对粒细胞集落刺激因子的影响 方法: 健康雄性Wistar大鼠通过结扎冠状动脉左前降支建立实验性心肌梗死动物模型。选取造模成功大鼠48只,按照随机数字表法随机分为模型组(M)、消心痛组(Y)、和血生络低剂量组(D)、和血生络高剂量组(G),每组12只;另设假手术组(J)大鼠12只。术后24h灌胃给药,药物干预3周后,每组取8只大鼠的血清ELISA法检测G-CSF在血清中的含量。 结果: 1血清中G-CSF的含量 模型组血清G-CSF含量为31.15±5.12较假手术组15.34±3.02明显增高(P0.05)。和血生络高剂量组、和血生络低剂量组、消心痛组血清G-CSF含量分别为66.61±8.46、38.23±9.76、52.59±7.18较模型组明显增高(P0.05)。和血生络高剂量组、消心痛组较和血生络低剂量组明显增高(P0.05),且和血生络高剂量组高于消心痛组(P0.05)。 第六部分 “和血生络法”对PI3K/Akt和MEK/ERK信号转导通路的影响 方法: 健康雄性Wistar大鼠通过结扎冠状动脉左前降支建立实验性心肌梗死动物模型。选取造模成功大鼠48只,按照随机数字表法随机分为模型组(M)、消心痛组(Y)、和血生络低剂量组(D)、和血生络高剂量组(G),每组12只;另设假手术组(J)大鼠12只。术后24h灌胃给药,药物干预3周后,每组取6只大鼠心脏组织RT-PCR法检测AKT mRNA在大鼠左室心肌组织的表达,用BIO-PROFIF凝胶图象分析系统对目的电泳条带进行分析,以相应的内参电泳条带作为参照,结果以两者之积分吸光度的比值表示。每组取6只大鼠心脏组织Western blot检测ERK1/2在大鼠左室心肌组织的表达,用凝胶定量软件Quantity-One-version 4.6.2测定各条带的积分吸光度,以积分吸光度代表蛋白质的表达量。 结果: 1 AKT mRNA在大鼠左室心肌组织的表达 假手术组大鼠为0.17±0.01,模型组大鼠为0.26±0.02,较假手术组大鼠显著增高(P0.05)。和血生络高剂量组、和血生络低剂量组及消心痛组大鼠分别为0.60±0.02、0.42±0.01、0.58±0.01。各治疗组明显高于模型组(P0.05)。和血生络高剂量组与消心痛组明显优于和血生络高低剂量组。和血生络高剂量组明显优于消心痛组(P0.05)。 2 ERK1/2在大鼠左室心肌组织的表达 假手术组大鼠为25470±1456,模型组大鼠为33703±488,较假手术组大鼠显著增高(P0.05)。和血生络高剂量组、低剂量组及消心痛组大鼠分别为54335±1021、40146±289、38361±1200,各治疗组明显高于模型组(P0.05)。和血生络高剂量组明显优于和血生络低剂量组及消心痛组(P0.05)。和血生络低剂量组明显优于消心痛组(P0.05)。 结论: 1“和血生络法”是冠心病的基本治法。 2和血生络法能够缩小心肌梗死范围,对大鼠心肌梗死具有治疗作用。 3和血生络法能够增加心肌梗死边缘区MVC/MVD,对缺血心肌具有促血管新生作用,从而有助于局部缺血状态的改善。 4和血生络法能增强心肌组织中bFGF蛋白和基因的表达,提高血清中bFGF的含量。由于bFGF是血管新生的重要生长因子,所以和血生络法促进bFGF产生是其促进血管新生的机制之一。 5和血生络法能够促进MMP-2的分泌,改变MMP-2、TIMP-2的比例,从而促进基底膜的降解,有利于内皮细胞的增殖和游走,为血管新生提供保障。 6和血生络法能提高血清中G-CSF含量,而G-CSF是骨髓中内皮祖细胞强有力的动员剂,可间接推论和血生络法通过动员内皮祖细胞进入外周血而促进血管新生。 7和血生络方能明显提高心肌中Akt及ERK1/2的表达量。说明和血生络法可通过激活Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt两条途径促进内皮细胞的增殖、迁移而实现了血管新生。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R259

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7 严萍;林久茂;陈宇宁;赵锦燕;庄群川;陈美华;叶盈;黄飞翔;;芎芍胶囊对心肌梗死大鼠缺血心肌血管新生作用[A];中华中医药学会心病分会全国第十二次学术年会暨中华中医药学会心病分会换届选举工作会议论文精选[C];2010年
8 杨祖福;胡婉英;秦志强;张明彩;付继航;;双龙丸对大鼠实验性心肌梗死血管新生的影响与分子学机制[A];第六次全国中西医结合心血管会学术会议论文汇编[C];2002年
9 张璐;胡豫;孙春艳;王雅丹;褚章波;;慢病毒shRNA干扰骨髓瘤细胞BDNF表达在骨髓微环境中对血管新生的影响[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
10 李慧玉;高少阳;郭冬梅;田元;朱江;王海霞;黄士昂;;HERG K+通道促进白血病诱导的血管新生研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 ;关木通对大鼠致癌性的实验研究[N];中国医药报;2003年
2 刘霞;诱导多功能干细胞让小鼠长出大鼠胰腺[N];科技日报;2011年
3 ;丹参能加快放创复合伤大鼠创面愈合[N];中国中医药报;2005年
4 郑健刚;杜元灏;石学敏;针刺能增加脑缺血大鼠脑血流量[N];中国医药报;2005年
5 ;新抗病毒抗生素17997在大鼠体内药代动力学和组织分布研究[N];中国医药报;2003年
6 ;刺五加皂甙对大鼠血管性痴呆有防治作用[N];中国中医药报;2005年
7 ;中药复方能逆转腹主动脉缩窄大鼠心肌肥大[N];中国中医药报;2005年
8 孙忻;人类首次获得克隆大鼠[N];科技日报;2003年
9 记者 许琦敏;大鼠有望成实验室头号“明星”[N];文汇报;2010年
10 阿胜;死亡阴影下孕育生机无限[N];医药经济报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 侯仙明;和血生络法对实验性心肌梗死大鼠的促血管新生作用及机制研究[D];河北医科大学;2011年
2 王大英;中药对心肌梗死后大鼠血管新生和心室重构的影响[D];复旦大学;2005年
3 刘虹;G-CSF动员骨髓干细胞治疗大鼠急性心肌梗死的疗效观察[D];复旦大学;2004年
4 于剑光;ABR功能低下导致大鼠心梗预后不良的血管新生机制[D];第二军医大学;2010年
5 王海燕;祛瘀生新法对脑梗死大鼠治疗性血管新生作用及机制研究[D];湖北中医学院;2005年
6 苏冠华;肝细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞移植的促血管新生作用[D];华中科技大学;2010年
7 孟舒;血管生成素相关蛋白2基因促进缺血心肌血管新生的研究[D];第二军医大学;2005年
8 张晓明;电针促进局灶性脑缺血大鼠脑内血管新生并减轻神经元损伤的研究[D];湖北中医药大学;2012年
9 李小卫;内皮细胞a7受体与血管新生之间关系的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
10 甘贤兵;慢性心力衰竭大鼠心交感传入反射的增强机制研究[D];南京医科大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘兵;rhG-CSF促进不同性别大鼠缺血后肢血管新生的实验研究[D];青岛大学;2009年
2 孙雨霏;骨髓间充质干细胞与血管平滑肌细胞在大鼠后肢缺血模型中促血管新生能力的比较[D];华中科技大学;2010年
3 向芳;围产期大鼠血脂组成与乳腺炎症相关基因的表达变化研究[D];四川农业大学;2011年
4 吴芳庚;环境温度变化致大鼠小肠黏膜免疫屏障损伤的研究[D];南昌大学;2011年
5 王宇;益心汤对实验性心肌梗死大鼠促血管新生的研究[D];湖北中医学院;2004年
6 杨科峰;基于BCI的大鼠运动行为控制的研究[D];郑州大学;2011年
7 钟丽敏;中枢M受体参与毒血症大鼠星形胶质细胞激活及细胞因子分泌的研究[D];苏州大学;2011年
8 彭晶;乳化异氟醚对成年大鼠学习记忆功能的影响[D];遵义医学院;2011年
9 刘金凤;螺虫乙酯对大鼠的生理影响及其体内分布检测方法的建立[D];东北农业大学;2011年
10 杜力;桂枝附子去桂加白术汤治疗大鼠弗氏完全佐剂关节炎作用机制的研究[D];辽宁中医药大学;2011年
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