硫化氢对大鼠急性心肌缺血损伤的作用及其机制研究

【摘要】：心血管疾病是当今人类致死率最高的三大疾病之一,其中缺血性心脏病是威胁人类健康的主要疾病,而且心脏外科手术过程中也存在急性心肌缺血。因此,有关急性缺血性心肌损伤的治疗措施、机制和预防是当今医学研究的热点之一。 内源性硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)主要由L-半胱氨酸和同型半胱氨酸等为底物在胱硫醚-β-合酶(cystathionine-β-synthase, CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)作用下生成。人们首先发现H2S可促进海马的长程增强效应,后来随着研究的深入,发现它参与了许多生理和病理生理过程,是继一氧化氮(nitric oxide, NO)和一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后的第三种气体信号分子。本实验室前期研究发现,在大鼠急性心肌缺血后其体内H2S/CSE体系下调,我们在此基础上于缺血后分别给予H2S供体硫氢化钠(sodium hydrosulfide, NaHS)和CSE抑制剂炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine, PPG),并从氧化应激、炎性细胞因子、细胞凋亡等方面探讨H2S在急性心肌缺血损伤中的作用及其可能作用机制。 第一部分硫化氢对大鼠急性心肌缺血损伤心肌组织氧化应激的影响 目的:观察H2S对大鼠急性心肌缺血损伤的影响,并从氧化应激方面探讨它的作用机制。 方法:健康成年雄性SD大鼠(270±20g)共48只,随机分为假手术组,缺血组,缺血+硫氢化钠(NaHS)低、中、高剂量组和缺血+炔丙基甘氨酸(PPG)组,每组8只。通过结扎大鼠左冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型。缺血组、缺血+NaHS低、中、高剂量组和缺血+PPG组大鼠分别于缺血3h时腹腔注射生理盐水、0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg NaHS及30 mg/kg PPG,假手术组只在大鼠左冠状动脉前降支下穿线但不结扎,各组大鼠均于术后6h时处死并取材。取材前Powerlab/8s多导生理仪记录各组大鼠左室发展压(LVDP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室压力变化速率(±dp/dtmax)等心功能指标;检测血浆中H2S含量、心肌组织CSE活性,以及心肌组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)活性;透射电镜观察心肌组织超微结构变化。 结果: 1与假手术组比较,缺血组大鼠心功能指标LVDP、±dp/dtmax明显降低,LVEDP明显升高(P0.01)。与缺血组比较,缺血+NaHS低、中、高剂量组大鼠心功能指标LVDP升高;缺血+NaHS中、高剂量组大鼠心功能指标±dp/dtmax明显升高,LVEDP明显降低;缺血+PPG组大鼠心功能指标LVDP、±dp/dtmax明显降低,LVEDP明显升高(P0.05或P0.01)。 2与假手术组比较,缺血组大鼠血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性降低(P0.01);与缺血组比较,缺血+ NaHS低、中、高剂量组大鼠两项指标均升高,而缺血+PPG组大鼠上述两项指标均降低(P0.05或P0.01)。 3缺血组与假手术组比较大鼠心肌组织MDA含量明显升高,SOD和GSH-PX活性明显降低(P0.01)。与缺血组比较,缺血+NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌组织MDA含量降低,SOD活性明显升高(P0.01);缺血+NaHS中、高剂量组大鼠心肌组织GSH-PX活性明显升高;缺血+PPG组大鼠心肌组织MDA含量升高,SOD和GSH-PX活性降低(P0.05或P0.01)。 4假手术组大鼠心肌纤维排列整齐,线粒体嵴和膜完整,核周隙稍扩张。缺血组大鼠心肌纤维排列紊乱,核质和核周高度水肿,核膜局部消失;线粒体嵴和膜严重肿胀变形,溶解,消失。与缺血组相比,缺血+NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌损伤明显减轻,尤其是高剂量组,肌纤维排列稍紊乱,线粒体基质轻度水肿。缺血+PPG组大鼠心肌损伤程度较缺血组加重。 小结:大鼠急性心肌缺血后应用NaHS可使H2S生成增加,减轻心功能损伤,抑制MDA的生成,增强SOD和GSH-PX活性,从而减轻心肌损伤。而应用CSE抑制剂PPG后可抑制CSE活性,减少H2S生成,促进MDA的生成,降低SOD和GSH-PX活性,从而加重心肌损伤。 第二部分硫化氢对大鼠急性心肌缺血损伤心肌组织炎性细胞因子的影响 目的:观察大鼠急性心肌缺血损伤时H2S对心肌组织NF-κB的表达及炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的影响,探讨心肌缺血时H2S的作用及其可能的机制。 方法:健康成年雄性SD大鼠(270±20g)共48只,随机分为假手术组,缺血组,缺血+硫氢化钠(NaHS)低、中、高剂量组和缺血+炔丙基甘氨酸(PPG)组,每组8只。通过结扎大鼠左冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型。缺血组、缺血+NaHS低、中、高剂量组和缺血+ PPG组大鼠分别于缺血3h时腹腔注射生理盐水、0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg NaHS及30 mg/kg PPG,假手术组只在大鼠左冠状动脉前降支下穿线但不结扎,各组大鼠均于术后6h时处死并取材。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清和心肌组织中IL-1β、IL-6和TNF-α含量;半定量PCR测定心肌组织中ICAM-1 mRNA表达;Westernblotting测定核内转录因子-κB(NF-κB)的表达。 结果: 1与假手术组比较,缺血组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的变化均显著升高(P0.01)。与缺血组比较,缺血+NaHS低、中、高剂量组大鼠血清中IL-1β和IL-6含量明显降低;缺血+NaHS中、高剂量组大鼠血清中TNF-α明显降低;缺血+PPG组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均升高(P0.05或P0.01)。 2与假手术组比较,缺血组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的变化均显著升高(P0.01)。与缺血组比较,缺血+NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌组织中IL-1β和TNF-α含量明显降低;缺血+NaHS中、高剂量组大鼠心肌组织中IL-6明显降低;缺血+PPG组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均升高(P0.05或P0.01)。 3缺血组与假手术组比较,大鼠心肌组织中ICAM-1 mRNA表达显著增强(P0.01)。与缺血组比较,缺血+NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌组织中ICAM-1 mRNA表达降低(P0.05或P0.01);缺血+PPG组大鼠心肌组织中ICAM-1 mRNA表达升高不明显。 4假手术组大鼠心肌组织仅有微量的NF-κB的表达;缺血组与假手术组比较,大鼠心肌组织中NF-κB表达均显著增加(P0.01)。与缺血组比较,缺血+NaHS中、高剂量组大鼠心肌组织中NF-κB的表达明显降低;缺血+PPG组大鼠心肌组织中NF-κB表达增加(P0.05或P0.01)。 小结:大鼠急性心肌缺血后给予NaHS可抑制NF-κB活化,下调IL-1β、TNF-α、IL-6和ICAM-1的表达,从而减轻心肌损伤。而给予PPG后,H2S生成减少,加重炎症反应,从而加重心肌损伤。 第三部分硫化氢对大鼠急性心肌缺血损伤心肌组织细胞凋亡的影响 目的:观察H2S对大鼠急性心肌缺血后心肌组织细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。 方法:健康成年雄性SD大鼠(270±20g)共48只,随机分为假手术组,缺血组,缺血+硫氢化钠(NaHS)低、中、高剂量组和缺血+炔丙基甘氨酸(PPG)组,每组8只。通过结扎大鼠左冠状动脉前降支建立急性心肌缺血模型。缺血组、缺血+NaHS低、中、高剂量组和缺血+PPG组大鼠分别于缺血3h时腹腔注射生理盐水、0.78 mg/kg、1.56 mg/kg和3.12 mg/kg NaHS及30 mg/kg PPG,假手术组只在大鼠左冠状动脉前降支下穿线但不结扎,各组大鼠均于术后6h时处死并取材。采用流式细胞术(FCM)检测心肌细胞凋亡率;免疫组化法检测心肌组织Bcl-2和Bax的表达;Westernblotting法检测心肌组织Caspase-3和Cyt-c的表达。 结果: 1缺血组大鼠心肌组织细胞凋亡率较假手术组明显升高(P0.01)。与缺血组比较,缺血+NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌组织细胞凋亡率明显降低;缺血+PPG组大鼠心肌组织细胞凋亡率明显升高(P0.05或P0.01)。 2缺血组大鼠心肌组织的Bax蛋白表达的阳性细胞百分率明显高于假手术组,而Bcl-2蛋白表达的阳性细胞百分率低于假手术组(P0.05或P0.01)。与缺血组相比,缺血+NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌组织Bax蛋白表达的阳性细胞百分率明显降低,Bcl-2蛋白表达的阳性细胞百分率明显升高(P0.05或P0.01)。与缺血组相比,缺血+PPG组大鼠心肌组织Bcl-2蛋白表达的阳性细胞百分率明显降低(P0.05),Bax蛋白表达的阳性细胞百分率升高不明显。 3假手术组大鼠心肌组织仅有少量的Caspase-3和Cyt-c的表达;缺血组大鼠心肌组织Caspase-3和Cyt-c蛋白表达较假手术组明显增强(P0.01)。与缺血组比较,缺血+NaHS中、高剂量组大鼠心肌组织Caspase-3蛋白表达明显减弱(P0.05或P0.01);缺血+NaHS低、中、高剂量组大鼠心肌组织Cyt-c蛋白表达明显减弱(P0.05或P0.01);缺血+PPG组大鼠心肌组织Caspase-3和Cyt-c蛋白表达明显增强(P0.05)。 小结:大鼠急性心肌缺血给予NaHS后,心肌细胞凋亡率降低,Bax、Cyt-c和Caspase-3蛋白表达减弱,Bcl-2蛋白表达增强,心肌损伤减轻;而给予PPG后加重心肌损伤。结果表明H2S可能通过抑制急性心肌缺血后心肌组织细胞凋亡起到心肌保护作用。 结论: 1大鼠急性心肌缺血后,心肌超微结构和心功能受损,H2S/CSE体系下调,氧化应激增强,给予NaHS可使H2S生成增加,减轻心肌结构和心功能损伤,减轻脂质过氧化反应,从而减轻心肌损伤。 2大鼠急性心肌缺血后血清和心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高,同时心肌组织中ICAM-1 mRNA和NF-κB蛋白表达也显著升高。给予NaHS后血清和心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量以及心肌组织中ICAM-1mRNA表达降低,NF-κB蛋白表达减弱,从而减轻心肌损伤,起到心肌保护作用。而给予PPG后,血清和心肌组织中TNF-α、IL-1β、IL-6含量以及心肌组织NF-κB蛋白表达增强,心肌损伤加重。 3大鼠急性心肌缺血后细胞凋亡增加,NaHS可降低心肌细胞凋亡率,减弱Bax、Cyt-c和Caspase-3蛋白表达,使Bcl-2蛋白表达增强,心肌损伤减轻;而给予PPG后,心肌细胞凋亡率升高, Cyt-c和Caspase-3蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱,心肌损伤加重。抑制细胞凋亡可能是H2S心肌保护作用机制之一。