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《河北医科大学》 2011年
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化疗介导结肠癌细胞免疫原性死亡的实验研究

高飞  
【摘要】:目的:探讨肿瘤化疗药物奥沙利铂(oxaliplatin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)对结肠癌细胞膜表面免疫原性相关蛋白--钙网蛋白(calreticulin,CRT)及主要组织相容性复合物(MHC I类分子)表达量的影响,寻找能够促使肿瘤细胞表面CRT及MHC I有效表达的理想药物浓度,为今后的化疗联合抗肿瘤免疫治疗提供基本的实验数据和理论支持。 方法:用CCK-8法检测奥沙利铂及5-FU对结肠癌细胞的生长抑制作用;用流式细胞术检测奥沙利铂及5-FU对肿瘤细胞主要组织相容性复合物(MHC分子)、钙网织蛋白(CRT分子)的表达的影响;免疫荧光法检测结肠癌细胞细胞膜表面的CRT表达。Annexin V/PI检测奥沙利铂、5-FU不同药物浓度及方式作用于结肠癌细胞24h后的凋亡情况。 结果: 1.CCK-8检测结果:奥沙利铂、5-FU对结肠癌细胞增殖的抑制率均随着药物浓度的增加而增大。其24h的半数抑制率浓度值(IC50)分别为:奥沙利铂组2.51,5-FU组46.22ug/ml。 2.不同药物对结肠癌细胞膜表面MHC I类分子表达的影响:用0.01mol/L PBS,2.51ug/ml奥沙利铂、46.22ug/ml 5-氟尿嘧啶干预结肠癌细胞24h后,流式细胞仪检测细胞表面MHC I类分子分子的表达量,相应的平均荧光强度分别为:PBS组1816.67±22.23;奥沙利铂组2602.00±19.52;5-Fu组3541.00±2.00。分别与对照组两两相比,均有显著性差异(P0.001)。其中以5-FU的作用较强。 3.不同药物浓度对结肠癌细胞膜表面MHC I类分子表达的影响: 1)随着奥沙利铂浓度的增加,细胞膜表面MHC I类分子的平均荧光强度也逐渐增加,各组与PBS对照组两两相比均有显著性差异(P0.001);各组药物浓度之间两两相比,也有显著性差异(P0.001)。2)随着5-氟尿嘧啶浓度的增加,MHC I类分子的平均荧光强度先是逐渐增高,后呈现下降趋势。各组与PBS对照组两两相比均有显著性差异(P0.001);各药物浓度间两两比较,也有显著性差异(P0.001),IC75浓度较IC50浓度荧光强度下降。 4 .不同药物对结肠癌细胞膜表面CRT分子表达的影响:用0.01mol/LPBS、2.51ug/ml奥沙利铂、46.22ug/ml 5-氟尿嘧啶干预结肠癌细胞24h后,流式细胞仪检测细胞表面CRT分子的表达量,相应的平均荧光强度分别为PBS组179.67±2.52 ;奥沙利铂组255.00±5.57 ; 5-Fu组236.00±3.61。各组分别与对照组两两相比,均有显著性差异(P0.05)。其中以奥沙利铂的作用较强。 5.不同药物浓度对结肠癌细胞膜表面CRT分子表达的影响:1)随着奥沙利铂浓度的增加,细胞膜表面CRT的平均荧光强度也逐渐增加,各组分别与PBS对照组两两相比均有显著性差异(P0.001);各组药物浓度之间两两相比,也有显著性差异,(P0.05)。2)随着5-氟尿嘧啶浓度的增加,CRT的平均荧光强度也逐渐增加。各组与PBS对照组相比均有显著性差异(P0.05);各药物浓度间两两比较,也有显著性差异,(P0.05)。 6.不同药物对结肠癌细胞凋亡的影响:用0.01mol/L PBS、2.51ug/ml奥沙利铂、46.22ug/ml 5-氟尿嘧啶干预结肠癌细胞24h后,流式细胞仪检测细胞凋亡,凋亡平均百分比(%)分别为:27.30±0.75;36.57±0.31;35.00±0.66。各组分别与对照组两两相比,均有显著性差异(P0.05)。其中,以奥沙利铂的作用较强。7.不同药物浓度对结肠癌细胞凋亡的影响:1)随着奥沙利铂浓度的增加,结肠癌细胞的凋亡百分比也逐渐增加,各组分别与PBS对照组两两相比均有显著性差异(P0.05);各组药物浓度之间两两相比,均有显著性差异(P0.05)。2)随着5-氟尿嘧啶浓度的增加,结肠癌细胞的凋亡百分比也逐渐增加,各组分别与PBS对照组两两相比均有显著性差异(P0.05);各组药物浓度之间两两相比,也有显著性差异(P0.05)。 结论: 1.以前研究已发现如表阿霉素、米托蒽醌等蒽环类药物及5-氟尿嘧啶都能通过诱导肿瘤细胞CRT膜转位促使肿瘤细胞免疫原性死亡,本研究发现,奥沙利铂也能促使结肠癌细胞膜表面钙网蛋白表达增加,并且本研究还发现5-FU及奥沙利铂同时也可以促使结肠癌细胞膜表面MHC I类分子表达增加,说明应该还存在其它细胞毒性药物,不止通过诱导钙网蛋白膜转位而且还可以通过增加MHC I类分子表达从而增强肿瘤细胞免疫原性,最终促进肿瘤细胞免疫原性死亡。 2.所用化疗药物浓度与膜表面钙网蛋白及MHC I类分子表达量存在相关性,而较低剂量的化疗药物就能促进钙网蛋白及MHC I类分子在细胞表面的有效表达,提示低剂量化疗药物浓度即可诱导有效的抗肿瘤免疫应答作用,进一步提示低剂量化疗药物浓度如能结合肿瘤细胞免疫治疗有可能增强免疫治疗的效果,在避免高剂量化疗药物毒副作用的同时,有效的对肿瘤治疗起到加强作用,但有待进一步动物试验进行验证。 本研究的结果提示:奥沙利铂、5-氟尿嘧啶能够有效诱导肿瘤细胞表面钙网蛋白及MHC I类分子表达的增多,从而为增强机体的抗肿瘤免疫提供可能。寻找能够有效诱导钙网蛋白膜转位及增强肿瘤表达MHC I类分子的化疗药物和合理的剂量,有可能为实现化疗联合抗肿瘤免疫治疗提供新的依据和参考。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R965

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【参考文献】
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