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《河北医科大学》 2012年
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KLF4在血管平滑肌细胞胞质中的定位和功能

刘琰  
【摘要】:目的:血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)表型转化是高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等血管重塑性疾病的主要细胞病理学基础。KLF4(Krüppel-like factor4)是Krüppel样转录因子家族的成员之一,该家族是具有锌指结构的一类转录因子家族,广泛的参与胚胎发育、细胞分化和癌症发生等过程。KLF4主要定位于胞核,通过激活分化标志基因(如SM α-actin、SM22α)的表达,发挥抑制细胞增殖、诱导分化的作用。目前对KLF4功能主要局限在细胞核,关于KLF4在胞浆的分布及其功能尚少有报道。我们前期研究发现,PDGF-BB可以促进KLF4表达和核输出,但KLF4在胞浆中的定位和功能尚不清楚。本研究以PDGF-BB为诱导因素,探讨了KLF4调节细胞骨架重构的分子机制。 方法:细胞免疫荧光染色分析检测KLF4与细胞骨架的相互作用;Western blot分析检测KLF4出入核的途径;GST pull-down分析检测KLF4与actin相互作用的结构基础;报告基因分析检测KLF4对SM22α启动子活性的影响。 结果: 1CRM1介导KLF4出核 用CRM1阻断剂LMB(20ng/mL)预处理VSMC8h后,再给予PDGF-BB(20ng/mL)刺激VSMC2h,分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白进行Western blot分析。结果显示,与对照组相比,LMB可以显著抑制PDGF-BB对KLF4出核的诱导作用。细胞免疫荧光染色结果也显示,与对照组相比,PDGF-BB处理增加KLF4在胞浆中的分布,给予LMB预处理后,胞浆中几乎看不到KLF4分布。提示,PDGF-BB通过CRM1途径诱导KLF4核输出。 2KLF4参与细胞骨架重构,具有稳定细胞骨架的作用 用pEGFP-N1和pEGFP-N1-KLF4质粒转染VSMC后,再用PDGF-BB、细胞骨架聚合剂(JPK)、细胞松弛素(CB)处理细胞,观察KLF4亚细胞定位的变化。细胞免疫荧光染色结果显示,对照组细胞含有大量平行束状纤维,PDGF-BB刺激后,束状分布的应力纤维减少,肌丝排列成为网状。CB刺激后,应力纤维消失,微丝解聚,呈弥散状分布于胞质中,细胞无法维持正常的形态。相反,JPK则使细胞应力纤维变的粗大。KLF4过表达可以促进肌丝成束,应力纤维增粗。转染KLF4后再给予PDGF-BB刺激,肌丝仍保持束状排列,没有明显的网格化改变;还发现过表达KLF4也可以抵抗CB诱导的应力纤维解聚,提示,KLF4在胞浆中有稳定细胞骨架的作用。 3KLF4通过与actin相互作用参与细胞骨架重构 为了明确KLF4参与细胞骨架重构及稳定细胞骨架的作用是否与其和SM α-actin相互作用有关,我们分别用PDGF-BB、CB、JPK处理VSMC2h后,观察KLF4与actin的相互作用。免疫双荧光细胞共定位分析结果显示,PDGF-BB使KLF4在胞浆中的分布增加,并与actin在胞浆外边缘相互重合为黄色荧光;CB使肌丝解聚为弥散状,且胞浆中TRITC标记的KLF4与FITC标记的actin无明显的荧光重叠;JPK使肌丝聚合呈束状,应力纤维粗大,KLF4与actin共定位更加明显。上述结果表明,KLF4通过与actin相互作用调节细胞骨架的解聚和聚合。 4KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin与KLF4结合所必须的 为了进一步明确KLF4与actin相互作用的结构基础,我们用KLF4不同截短体表达质粒转化宿主菌,经IPTG诱导后通过GST亲和层析纯化,得到分子量不同的的GST-KLF4-2、GST-KLF4-3、GST-KLF4-4、GST-KLF4-全长融合蛋白。将结合有5种融合蛋白的GST-Sepharose4B与VSMC融合蛋白裂解液共孵育8h,沉淀经充分洗涤后,进行SDS-PAGE分离及Western blot分析。结果显示,GST-KLF4-3与actin之间有较强的相互作用,其他融合蛋白上结合的actin较少。以上结果证实,KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin与KLF4相互作用的结构域。 5KLF4磷酸化和苏素化修饰影响细胞骨架的重构 为了确定KLF4修饰与细胞骨架重构的关系,我们分别用KLF4磷酸化位点Ser-251和Ser-255突变体表达载体和苏素化位点k-225+229突变体表达载体转染VSMC后,给予PDGF-BB刺激,细胞免疫荧光染色法观察不同突变体对细胞骨架重构的影响。结果显示,没有给予PDGF-BB处理时,各转染组细胞骨架均为束状,无明显区别;但是给予PDGF-BB后,转染磷酸化位点突变体的细胞,细胞骨架发生明显改变,表现为应力纤维增粗,向细胞边缘聚集,细胞形态由长梭形变为多角形。转染苏素化位点突变体后,应力纤维也增粗,但排列明显无序紊乱。提示PDGF-BB诱导的KLF4磷酸化和苏素化均参与了细胞骨架重构的调节。 结论: 1CRM1介导KLF4出核 2KLF4参与细胞骨架重构,具有稳定细胞骨架的作用 3KLF4通过与actin相互作用参与细胞骨架重构 4KLF4分子中第117-181位氨基酸是actin与KLF4结合所必须的 5KLF4磷酸化和苏素化修饰影响细胞骨架的重构
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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【参考文献】
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