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《河北医科大学》 2012年
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唑来膦酸联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂LBH589体外协同抗多发性骨髓瘤作用机制的研究

符皓  
【摘要】:目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是终末期B细胞克隆性增殖性恶性血液病疾病,在我国的发病率约为1/100000,但随着人口老龄化的增加, MM的发病率也有逐年增高的趋势。尽管近年来大剂量化疗以及新药沙利度胺、雷那度胺及硼替佐米的应用在临床治疗中已取得了较好的疗效,但多发性骨髓瘤仍然存在耐药及复发,因此还需要进一步研发新的药物。唑来膦酸是第三代二磷酸盐药物,已在国内外应用于MM骨病治疗及预防,有研究发现,唑来膦酸能够通过抑制骨髓瘤细胞中焦磷酸法尼酯合成酶,进而阻止小G蛋白异戊烯化引而起骨髓瘤细胞凋亡。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性,诱导靶细胞中组蛋白高度乙酰化,启动某些特异性基因的表达,从而阻断肿瘤细胞的生长。LBH-589是氧肟酸盐类HDACi,在实体瘤和血液系统肿瘤的临床前试验中均显示了抗肿瘤活性,包括强效的抗骨髓瘤活性。信号转导单元CD130(gp130)是IL-6受体复合物最重要的部分,IL-6在MM细胞生长以及存活中扮演着重要角色,下调CD130的表达能够影响对MM细胞生长促进作用。本实验探索了唑来膦酸联合LBH589对人骨髓瘤细胞株KM3细胞的协同抗肿瘤作用及对表面标志CD130的影响,为今后这两种药物联合应用于临床试验提供了理论基础和证据。 方法: 1细胞培养人多发性骨髓瘤细胞株KM3细胞,用含10%灭活胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液,置于37℃,50mL/L CO2的培养箱中培养。实验时细胞处于对数生长期,台盼蓝染色拒染率95%以上。 2细胞活性测定采用MTT法检测不同浓度(0.01、0.05、0.1、0.5、1μmol/L)的唑来膦酸、不同浓度(5、10、15、20nmol/L)的LBH589及不同浓度两药两两联合,在不同时间(24h、48h、72h)对KM3细胞增殖的影响。 3细胞凋亡检测不同浓度(0.01、0.05、0.1μmol/L)唑来膦酸、LBH589(5nmol/L、10nmol/L)及两药两两联合处理KM3细胞48h后,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。 4细胞周期检测:上述浓度的唑来膦酸、LBH589及两药联合处理KM3细胞48h后,应用流式细胞仪测定细胞周期。 5CD130表达水平检测:上述浓度的唑来膦酸、LBH589及两药联合处理KM3细胞48h后,应用流式细胞仪进行表面标志检测。 结果: 1MTT检测KM3细胞增殖抑制:KM3细胞经分别经0.01、0.05、0.1、0.5、1μmol/L浓度的唑来膦酸单药,5、10、15、20nmol/L不同浓度的LBH589单药及以上各浓度的唑来膦酸及以上各浓度的LBH589两两联合处理24h、48h、72h后,各组细胞抑制率不同程度增大,且随着药物浓度增加及作用时间延长,抑制率逐渐增大,差异有显著性(P<0.05)。将同一处理组不同时间两两比较,差异有统计学意义(P<0.05),同一时间不同浓度处理组两两比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明,唑来膦酸及LBH589可以抑制KM3细胞的生长,作用均呈剂量依赖性及时间依赖性。唑来膦酸与LBH589各浓度两两联合用药和单药组比较(48h)的CI值在0.535-1.180之间,而在两药浓度相对较小时的CI均小于0.9,表明两药对KM3细胞有协同抑制作用,协同作用最强组为唑来膦酸0.1μmol/L联合LBH5895nmol/L。 2流式细胞术检测KM3细胞凋亡:依据MTT结果调整唑来膦酸与LBH589的处理浓度及时间,唑来膦酸0.01、0.05、0.1μmol/L,LBH5895、10nmol/L及两种药物上述浓度两两联合处理KM3细胞48h,单药组及联合用药组均在G0/G1峰前出现了亚二倍体细胞峰,表明各组均出现了凋亡,唑来膦酸联合LBH589与两药单独应用相比增加了KM3细胞凋亡,差异有统计学意义(P<0.05)。 3流式细胞术检测KM3细胞周期:KM3细胞经过上述不同浓度的唑来膦酸、LBH589及两药联合作用48h后,(1)唑来膦酸单药组,随着唑来膦酸作用浓度增加,S期细胞比例升高,G0/G1期细胞比例降低,其中0.05μmol/L和0.1μmol/L组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而G2/M期细胞比例变化不明显,(2)LBH589单药组,随着LBH589作用浓度增加,G0/G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),G2/M期细胞比例变化不明显,(3)联合用药组,随着两药作用浓度增加,G2/M期细胞比例降低,其中唑来膦酸0.05、0.1μmol/L和LBH5895、10nmol/L两两联合组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),G0/G1期、S期没有差异。 4流式细胞术检测KM3细胞CD130表达:(1)唑来膦酸单药组,随着唑来膦酸作用浓度增加,KM3细胞CD130阳性细胞数逐渐减少,细胞表面CD130平均荧光强度也逐渐减弱,唑来膦酸0.05和0.1μmol/L组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),(2)LBH589单药组,随着LBH589作用浓度增加,KM3细胞CD130阳性细胞数逐渐减少,细胞表面CD130平均荧光强度也逐渐减弱,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),(3)联合用药组与对照组相比,随着两药浓度增加,CD130阳性细胞数明显减少,其细胞表面CD130平均荧光强度也明显减弱,加药组与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1在一定的浓度范围内,唑来膦酸及LBH589均可以抑制人骨髓瘤细胞株KM3细胞的增殖,其效应呈时间依赖性及剂量依赖性,并且二者联用具有协同作用。 2唑来膦酸及LBH589均可诱导KM3细胞凋亡。唑来膦酸可使KM3细胞阻滞于S期,而LBH589可使KM3细胞阻滞于G0/G1期,干扰肿瘤细胞周期可能为两药抗骨髓瘤的作用机制之一。 3唑来膦酸和LBH589均引起CD130阳性细胞数的减少及细胞表面CD130平均荧光强度的减弱,下调KM3细胞表面CD130的表达可能为两药抗骨髓瘤的作用机制之一。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R733.3

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