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《河北医科大学》 2012年
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青蒿琥酯抗骨髓增生异常综合征作用和机制的体外实验研究

王颖  
【摘要】:目的:骨髓增生异常综合症(myelodysplastic syndrome, MDS)是一组以骨髓无效造血和具有向AML转化倾向为特征的异质性强的恶性克隆性疾病,发病以老年人多见,无法承受强烈化疗和骨髓移植治疗,治疗相当棘手而疗效却很有限。目前仍为不可治愈的恶性血液病。高危MDS治疗效果差,多数患者不得不依赖输血生存,并最终转化为AML而死亡,预后极差。因此有必要寻找效果好骨髓抑制轻且经济的新药物来改善中高危MDS患者的预后。 青蒿琥酯(artesunate, ART)是自中药青蒿中提取的青蒿素的半合成衍生物。是一种安全有效的抗疟药。近年来发现其通过促进多种肿瘤细胞分化和程序性死亡,抑制肿瘤细胞增殖来抑制肿瘤。低浓度对正常细胞无明显细胞毒作用,高浓度时在动物实验发现有胚胎毒性、可逆性肾损伤和骨发育异常。高危MDS的特点是骨髓细胞高度增生,但存在无效造血而导致外周血三系减少,MDS的骨髓基质细胞异常导致化疗和移植后恢复慢,风险高。不能施行移植的高危MDS患者的治疗更需要寻找一种经济而安全有效的药物,以改善患者的生存质量。近几年FDA批准的用于MDS治疗的去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-aza-cytidine, Aza)和5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycitidine, DAC),一方面由于非靶向的细胞毒作用、潜在的致癌性、临床应用后耐药病例的出现以及昂贵的治疗费用,另一方面虽然改善输血依赖有效率达50%,但是较低的总反应率(10%-20%),限制了其在MDS的治疗应用。青蒿琥酯多年来用于抗疟治疗安全而有效,不良反应轻微,未见引起骨髓抑制的报道。青蒿琥酯对高危MDS细胞是否有治疗作用,目前国内外也未见相关研究。因此我们以高危MDS细胞系SKM-1细胞和原代MDS细胞为研究对象。观察ART能否诱导高危MDS细胞的凋亡,并探索凋亡的分子机制。 近来临床和实验研究显示表观遗传学异常在MDS发病和向白血病转化过程中起到关键作用,是临床治疗MDS很具前景的靶位。发挥异常甲基化状态维持作用的DNMT1在AML和MDS中转录水平明显高于正常,同时也是备受关注的表观遗传学治疗靶位。鉴于表观遗传学变化在MDS发生发展中的重要作用,在前期研究基础上从表观遗传学调节基因的角度来探讨ART作用于MDS细胞的机制,为ART用于高危MDS的治疗提供体外实验依据。 方法: 1CCK-8细胞活力实验检测ART处理后SKM-1细胞的活力,设空白对照、溶剂对照、Trolox预处理组及Ac-DEVD-CHO预处理组。检测正常对照骨髓单个核细胞、基质细胞、高危MDS患者的原代细胞和MDS转化的AML患者的原代细胞经ART处理前后的活力变化。DAC与ART联用的细胞活力实验采用析因设计进行试验,联用效应应用联用指数(CI)来评价。 2瑞氏-吉姆萨染色观察10μmol/L的ART处理24h后的SKM-1细胞和MDS原代幼稚细胞的形态学变化。 3PI染色检测ART处理SKM-1细胞24h后细胞周期的变化和亚二倍体峰的有无。 4JC-1阳离子脂质荧光染料染色检测用终浓度分别为1、5、10μmol/L的ART处理1h后的SKM-1细胞MMP变化,和10μmol/L的ART处理0.5、1、3、6、12、24h后的SKM-1细胞MMP变化。 5蛋白印迹(WB)检测终浓度为1、5、10μmol/L的ART处理SKM-1细胞6h后caspase-8、caspase-9、活性的caspase3、PARP、bid、AIF的表达。检测凋亡调节蛋白BCL-2、bax、bad、P-bad、survivin、XIAP。检测SKM-1(?)田胞生存通路PI3K/AKT主要信号蛋白Pten、Akt、P-Akt (Ser473)和P-Akt(Thr308)的变化。第二部分研究中,收集1、5、10μmol/L的ART作用6h后和10μmol/L的ART处理3h、6h、12h后的SKM-1细胞,以未加ART组作空白对照,检测DNMT1蛋白水平的变化。 6Fluo-3-Am荧光探针检测10μmol/L的ART处理0.5、1、3h后的SKM-1细胞内的钙离子浓度的变化。7DCFH-DA荧光探针检测10μmol/L的ART处理0.5、3、6、12、24h后的SKM-1细胞内活性氧簇的变化。 8细胞免疫荧光染色观察SKM-1细胞在10μmol/L的ART处理6h后是否存在AIF核内转位。 9RT-PCR检测DNMT1mRNA变化。分组收集1、5、10μmol/L的ART作用6h后和10μmol/L的ART处理3h、6h、12h后的SKM-1细胞,以PBS代ART组作溶剂对照,并设空白对照。 10荧光实时定量PCR检测分析ART处理前后p15INK4BmRNA变化,实验分组收集1、5、10μmol/L的ART作用12h后的SKM-1细胞,以PBS代ART组作溶剂对照,以80μmol/L的DAC为阳性对照。 11甲基化特异性PCR检测p15INK4B的启动子甲基化状态的变化。实验分组为未处理的SKM-1细胞、10μmol/L的ART处理12h后的SKM-1细胞、80μmol/L的DAC处理12h的SKM-1细胞。 12Annexin V/PI染色标记细胞检测DAC和ART联用组与单用组细胞凋亡率的差别。 结果: 1ART对MDS细胞系生长抑制作用呈时间和剂量依赖性。24h、48h和72h的IC50分别为154.1μmol/L、3.43μmol/L和1.92μmol/L。以终浓度为1、5、10μmol/L的ART处理MDS原代细胞48h,细胞生长呈不同程度的抑制,三例病人原代细胞的48h的IC50分别为36.05μmol/L118μmol/L、34.72μmol/L。以终浓度为1、5、10、100、200μmol/L的ART处理正常对照骨髓单个核细胞48h,细胞生长呈轻度抑制。48h的IC50均190μmol/L,分别为195.14μmol/L,531.88μmol/L,1683.96μmol/L以终浓度为1、5、10、100、200μmol/L的ART处理正常对照骨髓基质细胞仅轻度抑制其活力,而3例病人(MDS或MDS-AML)的48h的IC50均150μmol/L,分别为227.026μmol/L,154.03μmol/L,212.49μmol/L。抗氧化剂Trolox预处理减轻ART对SKM-1细胞的抑制,caspase3、7抑制剂Ac-DEVD-CHO部分减少ART对SKM-1细胞的抑制。 2瑞氏-吉姆萨染色显示ART作用于MDS细胞后可见凋亡小体、核碎裂等凋亡表现。 3经终浓度为1、5、10μmol/L的ART处理SKM-1细胞24h后,SKM-1细胞的周期阻滞于G0/G1期并伴亚二倍体峰出现,且亚二倍体呈剂量依赖性增加(p0.005) 4经1、5、10μmol/L的ART处理SKM-1细胞6h后,ART可诱导AIF转位入核(p0.005),呈剂量依赖性正相关,pearson相关性系数=0.740,P=0.003;高剂量时经内源通路激活csapase-9(p0.05),进而激活caspase-3(p0.005)、切割PARP而诱导细胞凋亡,casepase-9水平与ART剂量呈低度负相关(pearson相关性系数=-0.656,P=0.010),激活的casepase-3与ART剂量呈低度正相关(pearson相关性系数=0.553,P=0.031);切割的PARP与ART剂量呈低度正相关(pearson相关性系数=0.614,P=0.017)。终浓度为1、5、10μmol/L的ART处理SKM-1细胞12h未见caspase8和Bid有明显变化(p0.05)。对SKM-1细胞在10μmol/L的ART处理6h前后进行间接免疫荧光染色,AIF的核内转位可应用敏感的激光共聚焦显微镜观察到。 5经终浓度为1、5、10μmol/L的ART处理SKM-1细胞1h后线粒体膜电位(MMP)与ART呈剂量依赖性下降,单因素方差分析,F=230.12,P0.005;10μmol/L的ART处理0.5、1、3、6、12、24h后的SKM-1细胞MMP呈时间依赖性下降,Dunnett T3分析,P0.05,pearson相关性分析,r=0.702,P=0.011。 6细胞内钙离子在10μmol/L的ART处理后的0.5h即已经上升,持续至6h仍较对照组高,单因素方差分析F=274.848,P0.005;细胞内活性氧簇在10μmol/L的ART处理后的6h开始上升,持续至12h仍较对照组高,单因素方差分析F=255.266,P0.005;0.5h、3h和24h与处理前无明显差异P0.05。 7经1、5、10μmol/L的ART处理SKM-1细胞6h行总蛋白WB检测结果显示:Bad蛋白表达在ART处理后呈上升趋势,但与对照相比无统计学意义,F=0.598,P=0.639;P-Bad蛋白表达在ART处理后呈下降趋势,与对照组相比差异具显著性,F=22.034,P0.005,与ART剂量呈高度负相关性:pearson相关系数=-0.909,P0.005。BCl-2/Bax比值呈下降趋势并呈剂量依赖性(control Vs1μmol/L ART Vs5μmol/L ART Vs10μmol/L ART,1.775±0.24Vs1.2033±0.01Vs1.1743±0.26Vs0.833±0.02),单因素方差分析F=14.23,P0.005;相关分析显示pearson相关系数=-0.866,P0.005。XIAP蛋白表达在ART处理后呈下降趋势,与对照相比差异无显著性;Survivin蛋白表达在ART处理后呈下降趋势,与对照相比差异有显著性,F=19.172,P=0.001,和ART剂量呈高度负相关,pearson相关系数=-0.849,P0.005。 8经终浓度为1、5、10gmol/L的ART处理SKM-1细胞6h后Pten呈上升趋势,单因素方差分析:F=10.003,p=0.004,呈剂量依赖性,pearson相关系数=0.873,p0.005;P-Akt(Ser473)呈下降趋势,单因素方差分析:F=14.836,p=0.001,呈剂量依赖性,pearson相关系数=-0.854,p0.005;p-Akt(Thr308)呈下降趋势,单因素方差分析:F=5.851,p=0.021,呈剂量依赖性,pearson相关系数=-0.539,p0.05;在10gmol/L的ART处理后Akt呈有统计学意义的下降,单因素方差分析:F=8.177,p=0.008,但剂量依赖性不明显,pearson相关系数=-0.210,p=0.513如Fig.12所示。 9ART处理SKM.1细胞后DNMT1基因表达呈时间和剂量依赖性下降 10ART处理SKM-1细胞后DNMT1蛋白表达呈时间依赖性下降,剂量依赖下降不明显 11ART处理SKM-1细胞后DNMT1蛋白靶基因p15INK4B表达呈剂量依赖性上升,ART处理SKM-1细胞后DNMT1蛋白靶基因p15INK4B启动子甲基化程度下降,非甲基化启动子较ART处理前明显上升 12ART联合DAC对SKM-1细胞凋亡诱导作用呈正协同,高于各自单药的作用。5μmol/L的ART与受试浓度范围(1-1600μmol/L)的DAC均有正协同作用(CI=0.63、0.5、0.28、0.46、0.19,P0.005)。Ac-DEVD-CHO预处理不能抑制ART对DAC的凋亡诱导增强作用(P0.005) 结论: 1ART体外对高危MDS细胞系SKM-1和高危MDS原代细胞的细胞活力有明显抑制作用;对非血液病患者骨髓基质细胞和骨髓单个核细胞的活力有轻度抑制作用。 2ART可在体外诱导SKM-1细胞发生细胞周期阻滞,主要阻滞在G0/G1期,并伴有剂量依赖性出现的亚二倍体峰。 3ART在体外可诱导SKM-1细胞和高危MDS原代细胞发生凋亡 4ART对SKM-1细胞的损伤的早期事件是细胞内钙离子上升而后线粒体膜电位下降,接下来细胞内ROS的上升使得损伤持续和加重。 5ART对SKM-1细胞的抑制作用是以凋亡诱导为主,该种凋亡是通过内源性凋亡诱导途径启动的,经caspase依赖和非依赖途径进行的。 6BCL-2家族中BCl-2/bax比值下降、bad磷酸化水平的下降、IAP家族中survivin的下降是ART诱导凋亡作用在凋亡相关分子层面的作用机制之一 7PTEN/PI3K/Akt信号通路的负调控是ART诱导SKM-1细胞凋亡的信号转导机制之一。 8ART通过抑制DNMT1mRNA的转录和蛋白表达来恢复SKM-1细胞中的p15INK4b的表达,进而发挥其抑癌作用 9ART主要通过caspase-3非依赖通路增强DAC对SKM-1细胞的凋亡诱导作用
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R551.3

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