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《河北医科大学》 2012年
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前列腺素E2对子宫内膜异位症患者黄素化颗粒细胞甾体激素合成的影响及相关机制研究

王婧  
【摘要】:子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs,简称内异症)是一种常见的良性妇科疾病,约50%的内异症患者存在不育,但相关机制至今尚未完全阐明。除盆腔结构改变、免疫缺陷等因素外,卵巢自身功能障碍可能也是内异症导致不育的原因之一。内异症患者与输卵管因素不孕患者相比,具有卵泡生长速度减慢,优势卵泡减小,有更多空卵泡和闭锁卵泡发生及受精率降低等表现。而当内异症患者采用捐献卵子受精时,其胚胎植入率和妊娠率与采用自身卵子相比明显增高。这提示内异症患者卵巢功能存在异常。颗粒细胞是卵泡内分泌雌激素和孕激素的主要细胞,为卵母细胞的发育和成熟提供正常的卵巢内环境。因此,颗粒细胞可以作为简便可行的切入点研究内异症患者的卵巢功能。 卵泡液中生成的各种活性物质对卵母细胞和颗粒细胞的功能有重要调节作用。前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)是卵泡内具有促进卵泡发育,卵母细胞成熟和卵丘颗粒细胞黄素化的活性物质。有报道显示PGE2通过受体作用调节人黄素化颗粒细胞孕酮生成,且PGE2可以通过受体后PI3K/AKT、ERK1/2和NF-κB等信号通路调节卵泡内卵母细胞的减数分裂及卵丘颗粒细胞的扩增,但PGE2对颗粒细胞中甾体激素合成酶表达的影响及受体后作用机制还不清楚。另外,PGE2与内异症发病机制密切相关,且内异症患者腹腔液和血液中PGE2水平显著升高,而PGE2在内异症患者卵泡液中的表达及其对内异症患者颗粒细胞的影响还未见报道。因此,内异症患者卵泡液中PGE2水平如何,是因为其水平降低不足以促进颗粒细胞甾体激素合成,或是其信号通路在内异症患者颗粒细胞中作用机制异常导致卵母细胞的发育和成熟能力降低?到目前为止,这些问题尚悬而未决。 因此,本研究第一部分取因输卵管因素而行IVF-ET患者的黄素化颗粒细胞进行培养,探讨PGE2对人黄素化颗粒细胞甾体激素合成酶表达的影响;第二部分通过培养上述细胞探讨PGE2受体后信号通路对人黄素化颗粒细胞甾体激素合成的调节作用;第三部分检测内异症患者卵泡液中PGE2、雌二醇和孕酮的水平及PGE2与甾体激素水平相关性,并观察内异症患者IVF-ET的结局,探讨卵泡液中PGE2水平异常对内异症患者不育的可能影响;第四部分则取内异症患者和输卵管不育患者的黄素化颗粒细胞进行培养及PGE2干预,观察两组甾体激素及其合成酶的表达差异,并且检测内异症组和对照组PGE2信号通路的差异性表达,进一步认识PGE2信号通路对内异症患者颗粒细胞的调节作用。 第一部分PGE2对人黄素化颗粒细胞甾体激素合成酶StAR和CYP19A1的影响 目的:探讨PGE2对人黄素化颗粒细胞孕酮和雌二醇及StAR和CYP19A1表达的影响。 方法:收集因输卵管因素行IVF-ET患者的黄素化颗粒细胞,培养48小时后,用50ng/ml PGE2处理人黄素化颗粒细胞0h、6h、12h和24h,采用化学发光法、Real-time PCR和In-cell Western检测PGE2干预后,人黄素化颗粒细胞雌二醇和孕酮的分泌及CYP19A1和StAR的表达;再采用0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml和250ng/ml PGE2处理人黄素化颗粒细胞,干预时间根据上述结果而定,采用上述同法检测黄素化颗粒细胞雌二醇和孕酮的分泌及CYP19A1和StAR的表达。 结果: 1化学发光法结果 50ng/ml PGE2干预颗粒细胞6h后,与Oh组相比,作用时间6h(4.92±1.16vs1.36±0.21,p0.01)、12h(5.03±1.07vs1.36±±0.21,p0.01)及24h(4.09±0.92vs1.36±0.21,p0.05)时,细胞上清中孕酮水平均升高,而雌二醇的表达未见显著变化;PGE2干预颗粒细胞6h后,与0ng/ml组相比,50ng/ml (16.28±2.54vs11.51±1.55, p0.05)和250ng/ml(19.11±4.19vs11.51±1.55,p0.01) PGE2均显著促进颗粒细胞孕酮分泌,但雌二醇分泌未见显著增加。 2Real-time PCR结果 50ng/ml PGE2干预颗粒细胞后,与Oh组相比,作用6h及12h时,StAR mRNA表达增加;而干预24h后,StAR mRNA表达量与对照组相比无明显差异。PGE2干预颗粒细胞6h后,与0ng/ml组相比,50ng/ml和250ng/ml PGE2均显著促进颗粒细胞StAR mRNA的表达, CYP19A1mRNA表达未见显著变化。 3In-cell Western结果 50ng/ml PGE2干预颗粒细胞后,与Oh组相比,作用时间6h时,StAR蛋白表达增加,而PGE2干预后12h及24h, StAR蛋白表达量与Oh组相比无显著差异,且各时间点CYP19A1蛋白表达与Oh组相比均未见显著变化。PGE2干预颗粒细胞6h后,与对照组相比,50ng/ml和250ng/mlPGE2均显著促进颗粒细胞StAR蛋白的表达,但对CYP19A1蛋白表达未见显著影响。 4免疫组化结果 50ng/ml PGE2对人黄素化颗粒细胞干预6小时后,StAR和CYP19A1均主要在胞浆表达;且加药组与空白组相比,StAR蛋白表达增高,但CYP19A1蛋白表达未见明显差异。 结论: 1PGE2可以促进人黄素化颗粒细胞孕酮合成和StAR的表达,但对雌二醇的分泌和CYP19A1的表达无显著作用。 250ng/ml及250ng/ml PGE2在干预黄素化颗粒细胞6h时促进孕酮合成和StAR表达的作用显著。 第二部分PGE2信号通路在促进人黄素化颗粒细胞孕酮分泌及StAR表达中的作用 目的:探讨ERK1/2、AKT和NF-κB信号分子在PGE2促进人黄素化颗粒细胞孕酮分泌及StAR表达中的作用 方法:同第一部分取细胞培养48小时后,加入U0126处理细胞分为空白组、空白+U0126组、PGE2组和PGE2+U0126组;加入LY294002处理细胞分为空白组、空白+LY294002组、PGE2组和PGE2+LY294002组;加入PDTC分为空白组、空白+PDTC组、PGE2组和PGE2+PDTC组。采用化学发光法、Real-time PCR和In-cell Western检测各组孕酮及其合成酶StAR的表达。 结果: 1化学发光法结果 加入U0126后,U0126组与空白组相比孕酮合成增加(5.83±0.958vs4.51±0.72,p0.05),且PGE2+U0126组与PGE2组相比孕酮合成也增加(9.51±1.12vs7.47±0.57,p0.05);加入LY294002后,LY294002组较空白组孕酮水平降低(11.00±1.82vs13.58±2.13,p0.05),PGE2+LY294002组与PGE2组相比,孕酮合成水平也降低(13.23±1.87vs18.62±2.32,p0.05);加入PDTC后,PDTC组与空白组相比孕酮合成降低(4.17±0.99vs5.79±1.11,p0.05),而PGE2+PDTC组与PGE2组相比孕酮合成无显著变化。 2Real-time PCR结果 加入U0126后, U0126组与空白组相比StAR mRNA的表达增加,而PGE2+U0126组与PGE2组相比StAR mRNA的表达无显著变化;加入LY294002后,LY294002组与空白组相比StAR mRNA的表达降低,且PGE2+LY294002组与PGE2组相比StAR mRNA的表达也降低;加入PDTC后,PDTC组与空白组相比StAR mRNA的表达降低,但PGE2+PDTC组与PGE2组相比StAR mRNA的表达无显著降低。 3In-cell western结果 加入U0126后,U0126组与空白组相比StAR蛋白的表达增加,且PGE2+U0126组与PGE2组相比StAR蛋白的表达也增加;加入LY294002后,LY294002组与空白组相比StAR蛋白的表达降低,且PGE2+LY2940026组与PGE2组相比StAR蛋白的表达也降低;加入PDTC后,PDTC组与空白组相比StAR蛋白的表达降低,且PGE2+PDTC组与PGE2组相比StAR蛋白的表达未见显著差异。 结论: 1PGE2主要通过PI3K/AKT信号通路促进孕酮合成和StAR表达。 2ERK1/2和NF-κB信号分子参与调节黄素化颗粒细胞孕酮合成及StAR表达,但PGE2不主要通过ERK1/2和NF-κB信号通路调节孕酮合成及StAR表达。 第三部分PGE2在中、重度子宫内膜异位患者卵泡液中的表达及其与甾体激素合成的相关性研究 目的:检测内异症患者卵泡液中PGE2、雌二醇和孕酮的水平及PGE2与卵泡液中激素水平的相关性,观察内异症患者IVF-ET结局,探讨内异症卵泡液中PGE2可能对卵巢功能产生的影响。 方法:选择行IVF-ET的内异症不育患者33例,输卵管因素不育患者40例,检测卵泡液中PGE2、雌二醇和孕酮的水平,并统计两组患者IVF-ET结局。 结果: 1患者一般资料 两组患者年龄、体重指数、不育年限、月经第三天雌二醇和FSH水平以及周期治疗过程中给予的GnRH、FSH和hMG总量均无显著差异。 2患者IVF-ET结局 内异症患者卵巢内直径为12~16mm(6.25±1.92vs8.26±3.42,p0.05)和直径16mm(4.97±1.64vs6.32±1.58,p0.05)的卵泡数量低于对照组,最终获卵数较对照组也明显减少(6.73±5.01vs15.35±7.38,p0.01)。内异症患者hCG肌注当天血清中雌二醇水平降低(2096.38±1125.74vs3497.52±1389.73,p0.005),但最终两组的受精率和妊娠率未见显著差异。 3内异症患者卵泡液中PGE2、孕酮和雌二醇的水平 内异症患者卵泡液中PGE2(398.80±120.59vs318.8±159.9, p0.01)和孕酮(8.09±1.65vs5.85士1.71,P0.01)水平均高于对照组,但内异症患者卵泡液中雌二醇水平低于对照组(551.55±224.75vs786.87±224.48,P0.01)。内异症及对照组患者卵泡液中PGE2与孕酮水平均分别呈正相关(r:0.48,P0.01; r:0.43,P0.01)但内异症患者及对照组患者卵泡液中PGE2与雌二醇水平未见显著相关性。 结论: 1内异症患者卵泡液中及肌注hCG当日雌二醇水平降低,卵巢内卵泡数量和获卵数减少,提示内异症患者卵巢反应性低下,卵泡发育能力减低。 2内异症患者卵泡液中PGE2和孕酮水平升高,且两者呈正相关,提示内异症患者卵泡内PGE2调节卵泡发育过程与卵泡内甾体激素合成不协调,可能是内异症患者相关不育的原因之一。 第四部分PGE2对中、重度子宫内膜异位症患者卵巢黄素化颗粒细胞甾体激素合成的影响及其机制 目的:检测内异症患者甾体激素及CYP19A1和StAR表达的变化,以及PGE2对内异症患者颗粒细胞甾体激素及CYP19A1和StAR表达的影响,并检测内异症组PGE2信号通路的改变。 方法:分别取内异症患者和输卵管不育患者的黄素化颗粒细胞进行体外培养,并给予PGE2干预,分为对照(Con)组、PGE2组、EMs组和EMs+PGE2组采用观察内异症组和对照组甾体激素及其合成酶的表达差异,采用化学发光法、Real-time PCR和In-cell Western检测PGE2对雌二醇和孕酮及其合成酶CYP19A1和StAR的影响以及内异症组PGE2信号通路改变。 结果: 1化学发光法检测结果 EMs组与Con组相比,孕酮分泌水平升高(5.89±0.79vs3.24±0.41,p0.05),但雌二醇分泌水平降低(94±8.32vs116.25±14.68,p0.05)。EMs+PGE2组孕酮分泌水平较EMs组升高(6.88±0.93vs5.89±0.79,p0.05),且EMs+PGE2组较PGE2组孕酮分泌水平也升高(6.88±0.93vs4.79±0.86,p0.05)。但PGE2并未显著增加内异症患者颗粒细胞雌二醇的分泌。 2Real-time PCR结果 EMs组与Con组相比,StAR mRNA表达升高,但CYP19A1mRNA的表达水平降低。EMs+PGE2组与EMs组相比,StAR mRNA表达水平升高,且EMs+PGE2组较PGE2组StAR mRNA表达水平也升高。但PGE2干预后,对照组和内异症患者颗粒细胞CYP19A1mRNA的表达均未显著增加。 3In-cell western结果 EMs组与Con组相比,StAR蛋白表达升高,但CYP19A1蛋白的表达水平降低。EMs+PGE2组与EMs组相比,StAR蛋白表达水平升高,且EMs+PGE2组较PGE2组StAR蛋白表达水平也升高。但PGE2干预后,对照组和内异症患者颗粒细胞CYP19A1蛋白的表达均未显著增加。 内异症患者颗粒细胞中ERK1/2和磷酸化ERK1/2蛋白表达显著低于对照组;内异症患者颗粒细胞中AKT水平增加,但磷酸化AKT水平未见明显改变;内异症患者颗粒细胞中,NF-κB P65及磷酸化NF-κB P65的表达均降低。 结论: 1内异症患者黄素化颗粒细胞激素分泌异常,且PGE2可以进一步促进其孕酮分泌和StAR表达,提示内异症患者孕酮合成能力未受损。 2内异症患者PGE2信号通路中,PI3K/AKT信号通路未显著受损,但ERK1/2和磷酸化ERK1/2, NF-κB P65及磷酸化NF-κB P65表达均降低,这提示PGE2可能降低内异症患者颗粒细胞的增殖功能,但孕酮合成途径未显著受损。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R711.2

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10 赵永春;脲醛胶生产应向环保型发展[N];中国化工报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王婧;前列腺素E2对子宫内膜异位症患者黄素化颗粒细胞甾体激素合成的影响及相关机制研究[D];河北医科大学;2012年
2 金娟;PGE_2-EP_1信号转导通路在肝细胞癌中的作用及表没食子儿茶素没食子酸酯对其的影响[D];安徽医科大学;2012年
3 苗琳;PGE2调节前列腺中芳香化酶和钙结合蛋白S100A8分子机制的研究[D];南开大学;2010年
4 符晓阳;PGE1诱导血管新生的临床和实验研究[D];华中科技大学;2012年
5 白小明;PGE2对肝癌细胞生长与侵袭能力的影响及相关机制的研究[D];南京医科大学;2010年
6 孟保华;活血宁痛胶囊镇痛抗炎作用及对PGE2合成通路的影响[D];成都中医药大学;2009年
7 马娟;PGE_2通过FBP1调控肝癌细胞生长机制的研究[D];南京医科大学;2012年
8 颜艳;力刺激对类风湿性关节炎滑膜细胞中COX-2/PGE_2表达及细胞增殖调控研究[D];重庆大学;2012年
9 王乐禹;脂多糖、前列腺素E_2在骨再生中的作用[D];南方医科大学;2010年
10 张莹;前列腺素E2受体EP3在高血压肾病中的作用及其对钙离子浓度的影响[D];中南大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 申鑫鑫;PGE2对子宫内膜异位症患者黄素化颗粒细胞增殖与凋亡的影响[D];河北医科大学;2012年
2 吕慧敏;卵泡刺激素对体外培养人卵巢黄素化颗粒细胞增殖及分泌功能的影响[D];浙江大学;2012年
3 汪亦品;PGE_2对胆管细胞癌HuCCT1细胞侵袭能力的影响及相关机制的研究[D];南京医科大学;2011年
4 周志全;甲基苯丙胺中毒大鼠相关脑区COX-2、PGE_2表达的研究[D];昆明医学院;2010年
5 黄文勇;PGE_2上调SnoN蛋白表达促进胆管细胞癌CCLP1细胞增殖的分子机制研究[D];南京医科大学;2011年
6 白杨;PGE_2和IL1-β对体外培养兔子宫韧带成纤维细胞增殖的影响[D];郑州大学;2012年
7 于勇;PGE2在BLM致大鼠肺纤维化模型中的变化及意义研究[D];河北医科大学;2012年
8 欧阳林旗;15-PGDH介导PGE_2在人乳腺癌细胞多药耐药中的作用及机制研究[D];中南大学;2010年
9 史兆春;川芎白芷萃取物下调硬脑膜神经源性炎性介质COX-2、PGE2表达的研究[D];南京医科大学;2010年
10 许伟朋;TNF-α、PGE2和MMP-9在膝骨关节炎滑膜中的表达及意义[D];郑州大学;2012年
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