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《河北医科大学》 2012年
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血管紧张素Ⅱ对KCNQ1/KCNE1钾通道蛋白表达的调节

左旭  
【摘要】:延迟整流钾电流IK是人和哺乳动物的心室肌细胞动作电位主要的复极外化向钾电流,其中包括两种电流成分:慢激活(Slow delayed rectifierpotassium current,IKs)和快激活(Rapid delayed rectifier potassiumcurrent,IKr)。目前认为KCNQ1编码的α亚单位和KCNE1编码的β亚单位共同构成IKs钾通道。KCNQ1属于Kv钾通道家族KCNQ成员之一(KCNQ1-5或Kv7.1-7.5)。KCNQ1异源表达能产生快激活、慢失活的外向电流。迄今发现的五种KCNE蛋白都能够对KCNQ1通道功能起不同的调节作用,其中KCNQ1/KCNE1异源表达形成慢激活、慢去激活、无失活的电流,其电流动力学特征和药理学特征与心脏的IKs通道很相似。 业已证明,KCNQ1及KCNE1基因突变是引发离子通道病的分子遗传基础,包括通道功能下调相关的长QT综合征(LQT1、LQT5)或功能上调引发的短QT综合征(SQT2)。同时,越来越多的证据显示,许多心血管疾病状态下,如心肌肥厚,心衰等伴有IKs通道功能的下调,是获得性LQT产生的重要原因之一。无论是复极延迟的LQT或是复极缩短的SQT,都可能导致心律失常,特别是尖端扭转型室性心动过速,是高发心源性猝死的危险。因此研究IKs通道功能调节具有重要的意义。 肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)在调节心血管系统的正常生理功能以及高血压、心肌肥大、充血性心力衰竭等诸多心血管的病理过程中具有重要作用。血管紧张素II(AngII)是其该系统的主要体液因子,近年的研究表明AngII对心肌离子通道功能具有直接调控作用。在先前我们的试验中,发现AngII通过激活AT1受体对豚鼠心室肌细胞上I_(Ks)呈急性下调,已知AT_1受体激动产生的效应包括急性作用(发生在几分钟内)和慢性作用,后者常常为基因转录和转录后调节。然而AngII对I_(Ks)通道的慢性调控作用尚不清楚。本研究用分子生物学、免疫荧光显微镜等实验技术,在异源表达体人胚胎肾细胞(HEK293)上共表达人的KCNQ1、KCNE1以及人AT1受体cDNA,24h后,观察AngII对KCNQ1/KCNE1通道慢性调控作用,并分析了细胞内的信号转导通路第一部分AngII对KCNQ1通道蛋白表达的影响 目的:观察不同浓度及不同时间AngII对KCNQ1通道蛋白表达的影响。 方法:在HEK293细胞上运用Lipofectin2000转染试剂瞬时共转染带标签的V5-KCNQ1或Myc-KCNQ1、KCNE1及人AT1受体cDNA,24h后,运用特异性抗标签抗体,western blot技术检测AngII在不同浓度、不同时间对KCNQ1通道蛋白表达的影响。运用免疫荧光共聚焦显微镜技术观察AngII对细胞膜上通道蛋白表达的影响。 结果:(1) Ang II与细胞孵育24h可明显降低KCNQ1蛋白含量,Ang II在10、100、1000nM浓度下蛋白含量分别是对照的80%、68%、67%,;(2)Ang II(100nM)不同时间(2、6、12、24h)孵育后通道蛋白的下调出现在12小时;(3)免疫荧光实验进一步证实,给予AngII(100nM)24h后,细胞膜上的通道蛋白荧光强度明显减弱。 结论:在异源表达系统,长时间孵育Ang II能够引起KCNQ1通道蛋白的表达量下降。第二部分PKC信号通路对Ang II作用的影响 目的:异源表达细胞线上分析AngII对KCNQ1通道慢性调控作用的细胞内信号转导通路。 方法:采用脂质体瞬时转染方法,在HEK293细胞共转染带标签的V5-KCNQ1、KCNE1及人AT1受体cDNA24h后,运用特异性抗标签抗体,western blot技术检测观察使用PKC抑制剂或激动剂对Ang II下调KCNQ1通道蛋白表达的影响。 结果:(1) PKC抑制剂Bis-1(100nM)与细胞孵育30min后再加入Ang II(100nM)共同作用24h,与单独孵育Ang II相比通道蛋白表达含量出现了明显增加现象,说明Bis-1可拮抗Ang II的作用;(2) PKC激动剂PMA(100nM)细胞孵育30min后再加入Ang II(100nM)共同作用24h,与单独孵育Ang II相比通道蛋白表达量亦明显增加,其蛋白含量为对照组的97%,表明长时间孵育PMA使PKC耗竭后可拮抗Ang II的作用;(3)单用PKC激动剂PMA分别作用细胞30min及24h,PMA作用30min的蛋白含量为对照相的49%,而24h蛋白的表达含量为对照组的95%;PKC激动剂OAG孵育30min及24h后,通道蛋白表达量分别为对照的46%和40%,表明直接激动PKC下调通道蛋白表达,PMA具较强的PKC激活作用,长时间孵育导致PKC耗竭后其下调作用消失。 结论:AngII通过激动AT1受体、激活PKC信号通路而下调KCNQ1通道蛋白。第三部分KCNE1-S102突变对AngII作用的影响 目的:因近期有研究显示,PKC可通过KCNE1上S102磷酸化加速通道蛋白入胞降解,本实验观察在Ang II对突变通道KCNQ1/KCNE1-S102A的作用,分析Ang II调节通道蛋白的可能机制。 方法:采用脂质体介导瞬时转染方法,在HEK293细胞共转染带标签的V5-KCNQ1、KCNE1、KCNE1-S102A及人AT1受体cDNA24h后,运用特异性抗标签抗体,应用western blot技术检测KCNQ1蛋白含量,比较AngII对KCNQ1/KCNE1、KCNQ1/KCNE1-S102A通道作用的差别。 结果:共转染WT-KCNQ1/KCNE1后,分别给予AngII(100nM)、PKC激动剂OAG(100nM)24h后,通道蛋白含量分别为65%和40%,共转染的KCNQ1/KCNE1-S102A通道上,蛋白含量为66%和43%,表明Ang II和直接激动PKC两种通道蛋白的调节无明显影响,提示AngII下调通道蛋白并非通过KCNE1上S102位点的磷酸化。 结论:KCNE1-S102突变不影响Ang II对KCNQ1/KCNE1通道蛋白的慢性下调。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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