人脂肪干细胞协同颗粒脂肪移植的实验研究

【摘要】：目的：在体外特定的条件下，将人脂肪干细胞（ADSCs）扩增后混合人的颗粒脂肪，将其移植于裸鼠的背部筋膜下，研究并探讨脂肪干细胞在脂肪移植中向脂肪细胞的分化以及促进血管再生的能力，同时探讨移植物中干细胞与颗粒脂肪的最佳比例，为人脂肪干细胞在脂肪移植中的临床应用提供进一步的理论依据。 方法： 1脂肪干细胞的提取：无菌条件下提取人脂肪组织15g，磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗干净以去除残留血液，眼科剪和眼科镊剔除脂肪组织中可见结缔组织和血管，剪碎至大小为3mm的细小颗粒,将其置于Ⅰ型胶原蛋白酶浓度为0.075%的PBS中，在37℃条件下震荡消化30min，将消化液移入离心管，在800g离心力下离心10分钟,100目筛网过滤离心管中沉淀物，所得细胞提取物用DMEM培养液（含10%的胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、5mg/ml肝素和2ng/ml酸性成纤维细胞生长因子）[1]重悬,以适当密度接种于无菌培养瓶中，在37℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度的孵箱内培养，48h后半量换液，以后每隔3d进行换液操作，当原代细胞基本长满培养瓶底部时,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液将贴壁的细胞消化,按照1∶3的比例进行传代，接种于无菌培养瓶中,以后传代均进行以上重复操作。同时使用流式细胞术对即将进行动物实验的细胞进行表面抗原表达情况的分析。 2Brdu标记脂肪干细胞：脂肪干细胞传至第4代，加入终浓度为10μg/mL的Brdu，48h后检测标记率。其余标记细胞经胰蛋白酶消化后混合颗粒脂肪，进行动物实验。 3颗粒脂肪分离：从临床手术中提取人类废弃的脂肪组织，使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）液冲洗，将残留的血液去除干净后，将颗粒脂肪剪碎至0.5～1mm3，置于50mL离心管中，加入适量的干细胞培养基（DMEM/F12），在1200r/分的转速下离心3分钟，得到最终的颗粒脂肪。 4对移植颗粒脂肪进行称重：将颗粒脂肪剪碎离心后，放置于离心管中，对离心管中颗粒脂肪进行称重，将实验组分为A组、B组、C组、D组共4组，分别加入第4代Brdu标记的脂肪干细胞，干细胞与颗粒脂肪比例依次为105:500mg、3×105:500mg、6×105:500mg、9×105:500mg，对照组为单纯颗粒脂肪。1mL注射器称重后抽取500mg颗粒脂肪。 5颗粒脂肪移植：将含有ADSCs的500mg颗粒脂肪注射在裸鼠左侧背部筋膜下，500mg单纯的颗粒脂肪注射在裸鼠右侧背部筋膜下。 6移植颗粒脂肪的检测：于移植后28天时将裸鼠处死，取出背部移植颗粒脂肪，剥离掉移植物周围包膜，放置于电子天平上称重，并记录。之后置于4%多聚甲醛中固定，对移植物进行石蜡切片，分别进行苏木精-伊红染色、内皮细胞标志物CD34的检测以及BRDU抗体标记物的检测。 结果： 1脂肪干细胞（ADSCs）分离、培养及鉴定：细胞提取物经DMEM培养液重悬后，以适当密度接种于无菌培养瓶中，培养3-5天后可观察到多角形细胞及梭形细胞，之后多角形细胞逐渐变形为梭形细胞。 2流式细胞术检测：结果显示ADSCs阳性表达CD29、CD44、CD90，而CD31、CD45、CD146几乎不表达，证明分离培养获得的细胞为较纯化的间充质干细胞。 3ADSCs对移植颗粒脂肪重量的影响：移植4周后实验组A-D组移植物平均重量分别为(354.22±8.44)mg、(413.79±7.30)mg、(465.53±5.18)mg，(470.42±3.87)mg，重量维持率分别为70.84%、82.76%、93.12%、94.08%。对照组平均重量为(272.37±9.73)mg，重量维持率为54.47%。统计结果显示，除C、D两组重量之间无统计学差异外，其他任意两组均有统计学差异。 4检测移植脂肪的微血管数量：在实验组及对照组的中央区和周边区取各5个视野，之后对每个视野中的微血管数量进行计数。利用血管内皮细胞的特异性表面抗原CD34，对切片做免疫组织化学处理，计算出每组每平方毫米面积中的微血管的数量，用均数±标准差的形式来表示。中央区的血管数量在A-D组实验组分别为53.43±8.64个，65.74±7.07个，76.79±5.36个,80.34±4.83个，对照组为38.04±9.10个。周围区的血管数量在A-D组实验组分别为65.20±8.14个，77.55±7.37个，88.30±6.33个，91.89±5.61个，对照组为47.42±9.96个。利用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。无论是中央区还是周边区，实验组与对照组之间均有统计学差异（P＜0.05），说明实验组的中央区和周边区的血管数量大于相应的对照组的血管数量；4组实验组进行比较，无论是中央区还是周边区，除了C组与D组无统计学差异外，其他两两比较均有统计学差异（P＜0.05），说明移植干细胞与颗粒脂肪之间存在一个最佳比例，即在此基础上再增加干细胞的数量也不会增强移植脂肪的血供；各个实验组及对照组进行组内比较，均有统计学差异（P＜0.05），说明同一组中，中央区血管数量少于周边区的血管数量 5免疫组织化学染色在4组实验组中均检测到BrdU抗体阳性，说明移植的ADSCs已成活。而对照组BrdU抗体检测则呈阴性。 结论： 1体外提取的脂肪干细胞（ADSCs）与颗粒脂肪混合，移植与裸鼠背部筋膜下后，其中一部分ADSCs转化为了脂肪细胞，构成受区有生命力的正常脂肪组织。 2移植的脂肪干细胞可能通过旁分泌的方式促进血管形成，加快移植脂肪组织的新生血管网的重建，从而保证移植脂肪组织有充足的血供，进而降低移植脂肪组织的坏死及吸收率。 3ADSCs能够加快新生血管网重建的速率，而新生血管网重建反过来又提高了移植脂肪的成活率。 4ADSCs能转化成新生的脂肪细胞，当一部分成熟的脂肪细胞凋亡时，新生的脂肪细胞将对脂肪组织进行持续的补充和更新。 5脂肪干细胞混合颗粒脂肪移植，两者存在一个最适比例，将来运用于临床可最大化的发挥脂肪干细胞的作用。 6本实验证实了脂肪干细胞可作为种子细胞，在脂肪组织移植中发挥重要作用。

【关键词】：脂肪干细胞（ADSCs） 脂肪组织 脂肪移植 血管密度 注射 种子细胞
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R622.9
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