糖尿病大鼠肾脏细胞增殖、肥大、凋亡的动态变化及R-A系统阻断剂的影响

张艳玲  

【摘要】： 糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)以早期肾脏体积增大和晚期肾小球硬化为特征。早期肾脏体积增大主要是由细胞增生、肥大共同造成的，细胞的生长状态受细胞周期调节蛋白的调控，包括细胞周期蛋白(Cyclins，如CyclinA、CyclinD、CyclinE等)、细胞周期蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase，CDKs，如CDK2、CDK4等)、细胞周期蛋白激酶抑制剂(Cyclin-kinase inhibitors,CKI，如P16、P21、P27等)。随着病变进展，肾脏体积缩小，肾小球结节状硬化，肾小管萎缩，这一过程的发生机制尚未完全阐明。既往曾观察到在糖尿病肾组织中凋亡细胞数增多，并伴随着凋亡相关基因的改变，因此，肾脏细胞的增殖、肥大与凋亡可能参与了糖尿病肾病的发生、发展过程。基础与临床研究表明，肾素-血管紧张素系统(Renin-Angiotensin system，R-A系统)阻断药物如血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin convening enzyme inhibitor，ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ拮抗剂(Angiotensin Ⅱ receptor Ⅰ antagonism，AT1Ra)具有明显的肾脏保护作用，但其作用机制未完全阐明。我们应用大鼠糖尿病模型和高糖培养系膜细胞，从整体、细胞和分子等不同水平，系统观察了糖尿病肾组织细胞增殖、肥大、凋亡的动态变化及其调控，以及R-A系统阻断的影响。 1．糖尿病早期肾脏肥大及细胞周期相关基因的表达 应用实验性糖尿病模型和体外培养的系膜细胞，观察糖尿病早期肾脏细胞增殖，肥大及其调控，并采用基因芯片技术，观察糖尿病肾脏肥大期细胞周期相关基因的改变。 SD大鼠随机分为正常对照组和糖尿病(diabetes mellitus，DM)组，DM组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ，65mg／kg)制成糖尿病模型，分别于注射STZ后3、5、9、14、30天每组取6只大鼠，称重后收集24h尿；腹腔注射5溴脱氧尿核苷BrdU(100μg／kg)，两个小时后处死 中文摘要 动物分别留取血清和肾组织，进行光镜观察和图像分析，应用免疫组化 检测BrdU掺入率，流式细胞仪测定细胞周期调节蛋白CyClinE、CDKZ、 p‘’的表达。 注射 STZ天取材一次，每组取 6只大鼠，无 RNA酶污染条件 下取肾皮质混合，一步法提取肾皮质总RNA，OligOAt纤维素抽提和纯 化InRNA，对照组和糖尿病组的InRN在逆转录时分别应用Cy3和 Cys荧光素标记。将标记了荧光素的CDNA与细胞周期相关基因表达谱 芯片杂交，扫描并分析杂交结果。Cts什t3”ratio值在 0．5上刀 H外且一 对D皿N＞基因表达趋势一致的基因为表达有差异基因，rat。值＞2刀表 明OM组该基因上调，r扣。值＜o．5表明＊M组该基因下调。 体外培养系膜细胞哈lomerular mesangial cell，GMC），观察局糖 对系膜细胞［‘切胸腺啼咙核昔叮’出－hymidine，［’叨－hy）和［’m亮氨 酸叮＊－leucine，［’团七u）掺人率的影响，流式细胞术和兔疫组化观 察高糖对GMC增殖、肥大的影响及定量检测细胞周期蛋白CyClinE、 CDKZ、P”的表达。 结果：l、体视学及肾重／体重比的变化：与对照组相比，肾小球细 胞数5天开始增加，9天最多，14天维持9大的高水平，30天时有所 减少；肾小球直径从第 5天开始明显增大，14天时平均达 6．8 u m，30 天较14天略有增加怕．9 p叫。肾小管细胞数从3天开始增加，其变化 趋势与肾小球大致相同；肾小管直径从第3天开始增大，随病程延长逐 渐增大；与对照组相比，DM组的肾重／体重比从第5天开始即显著增 高，14天达到高峰，第30天仍维持在一较高水平d／肾皮质细胞BrdU 掺入率的变化：对照组整个观察过程肾小球、肾小管很少见到BrdU阳 性细胞，DM组则小球、小管中均可见到阳性细胞，小球中的阳性细胞 数在3天即明显增多，5天达高峰，后逐渐减少，30天恢复到与对照组 相当水平。肾小管也有相同趋势。3、肾皮质 CyClind、CDKZ、p”表达 的动态变化：对照组CyClinE在5天时显著增高并达高峰，14天时即己 降至接近正常水平；CDKZ从 3天到 14天均处于较高水平，峰值在 5 无；P”则从 14天才开始升高。4、在差异表达的 19条细胞周期相关基 因中，糖尿病组一条基因下调，该基因还与DNA结合、转录有关；上 调的18条基因中，还与免疫相关的基因3条，与代谢有关的基因2条， 2 中文摘要 细胞信号和传递蛋白相关基因2条，与细胞骨架和运动相关基因和原癌 抑癌基因各1条，其余均只与细胞周期相关。 细胞培养结果：l、高糖无血清培养 12h的 GMC［’田孔y掺入率较 正常糖无血清培养明显增高，24刁2h则比正常糖浓度组明显降低；入 高糖培养24刁2h的GMC［’m－fen掺入率较正常糖无血清培养明显增高。 工 高糖无血清培养 12h增殖指数较正常糖无血清培养明显增高，24、 48、72 h时两组比较差异无显著性；4、流式细胞和免疫细胞化学结果 发现，与正常糖浓度比较，12h时高糖组 CyClinE、CDKZ表达增强， 随着时间延

【关键词】：糖尿病肾病 细胞凋亡 凋亡相关基因 增殖 肥大 细胞周期相关基因
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2002
【分类号】：R587.1
【DOI】：CNKI:CDMD:1.2002.100511
【目录】：

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