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《河北医科大学》 2003年
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抗骨桥蛋白抗体防治动脉粥样硬化的实验性研究

张永红  
【摘要】: 目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种心血管系统的炎症性疾病,炎症反应贯穿于AS的整个病理过程。骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是细胞外基质的一种粘附性蛋白,可由增殖活跃的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)合成和分泌,具有诱导细胞粘附及迁移的作用。此外,OPN还具有类细胞因子的作用,参与炎症反应。在AS发生发展过程中,OPN发挥着重要作用。本实验以抗OPN抗体为药物通过静脉给药阻断血管损伤部位OPN的功能,观察了对AS的防治作用,并对其作用机制进行了初步探讨。 方法: 1. 动物模型的建立及分组:将12只SD大鼠随机分为两组,模型组和预防组,每组6只。模型组,连续三天灌胃给予VitD3(总量为50万单位/kg),之后用高脂饲料以15g/只/天喂养21天。预防组,在给予VitD3灌胃和高脂饲料的同时,经尾静脉注射抗OPN单克隆抗体(滴度为1:1000),其用法为:0.5ml/次,隔日一次,共7次。实验前及实验后分别测大鼠的体重。每次注射抗OPN抗体后0、2、4、6、8、10、12小时及24小时测肛温。实验中观察大鼠的一般情况。两组动物分别于实验前及实验开始后10天、17天及24天取血,分离血清,用于C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和Ca2+含量的测定,并于最后一次取血后将大 WP=4 鼠处死,留取主动脉血管进行病理切片、平滑肌α-肌动蛋白(SM-αactin)免疫组化染色、OPN Western印迹和组织Ca2+含量的测定。 2. SM-αactin免疫组化染色:石蜡切片常规脱蜡,微波抗原消化5min。封闭液室温孵育10min。加入1:1000稀释的特异性SM-αactin单抗(阴性对照用PBS代替),湿盒4℃过夜。继而依次与生物素标记的二抗(1:1000稀释)和辣根酶标记的链霉卵白素于37℃孵育15min。用DAB显色。 3. OPN Western印迹分析:取对照组和预防组大鼠主动脉蛋白提取液进行SDS-PAGE,电印迹转至硝酸纤维素膜上,依次与一抗、二抗进行结合反应,Western印迹结果用凝胶成像分析系统进行定量分析。 4. 血清及组织Ca2+含量的测定:用全自动生化分析仪测定,具体操作按试剂盒说明书进行。 5. 血清中炎性因子含量的测定:采用免疫浊度法测定CRP含量,用放免平衡法测定TNF-α含量。 结果: 1. 一般情况的变化:实验前后两组大鼠的体重基本上无多大变化,两组间无明显差异。预防组大鼠前四次尾静脉注射抗OPN抗体后,体温在8小时之内升到最高,达38.4±0.14℃(P0.05),之后体温下降,从12小时到24小时,体温基本降至正常范围内。后三次注射抗体后,体温不再出现升高的现象。整个实验过程中,模型组大鼠的体温在正常范围内波动。两组大鼠的一般情况良好。 2. 形态学变化:主动脉切片显示,模型组可见血管内皮下间隙增宽,内含小空泡,有些部位可见大空泡;中膜VSMC WP=5 增生,排列紊乱或隆起,中膜弹性膜紊乱、断裂;有些部位有明显的钙化形成,钙化区周围可见到泡沫细胞。预防组仅见少许泡沫细胞分布于病变部位;中膜VSMC排列也较紊乱,但增生较轻;弹性膜轻度紊乱、偶见断裂;钙化区较少且不明显,未见到大空泡的形成。结果提示,预防组的病变程度较模型组轻。 3. 血管壁中VSMC表型标志蛋白的表达变化:SM-αactin是分化型VSMC的标志蛋白。免疫组化结果表明,模型组血管壁中阳性染色颗粒较预防组少,而且着色也较淡。OPN是去分化型VSMC的标志蛋白。Western印迹分析表明,模型组OPN的表达量是预防组OPN表达量的1.2倍。SM-αactin的变化与AS病变程度成反相关,而OPN的表达量与AS病变程度成正相关。上述结果提示,AS病变部位的部分VSMC由分化型变为去分化型,导致SM-αactin合成减少,OPN合成增加。给予抗OPN抗体后,通过中和动脉壁损伤部位的OPN,在一定程度上抑制了VSMC表型转化,起到减缓AS进展的作用。 4. 血清及组织Ca2+水平的变化:模型组和预防组10天时的血Ca2+水平显著升高(P0.05),随着时间的延长,两组的血Ca2+含量又呈下降的趋势,17天和24天的血Ca2+均比实验10天时的血清Ca2+低并有显著性差异(P0.05);在相同时间点两组间的血Ca2+含量,均无差异(P0.05)。此外,两组间血管壁组织中Ca2+含量比较也无统计学意义(P0.05)。由此推测,实验初期,血钙的明显升高与大剂量的VitD3所致的骨钙动员和钙吸收增加有关。 5. 血清中炎性因子含量的变化:CRP和TNF-α是早期 WP=6 炎症反应的两种较为敏感的指标,本实验观察到,随着实验天数的增加,模型组和预防组大鼠血清CRP含量均急剧上升。与实验前相比,实验开始后10天、17天以及24天的CRP含量均明显升高(P0.05)。各时间点之间的CRP含量有显著性差异(P0.05)。模型组和预防组大鼠各时间点TNF-α水平变化均不明显(P0.05)。在同一时间点,两组之间的CRP和TNF-α含量比较均无差异(P0.05)。提示,TNF-α并非是AS病变部位的主要炎性因子。抗OPN抗体可能主要通过局部作用来减缓病变进展的。 结论:OPN作为AS病变部位合成和分泌的一种炎性因子,在AS发展过程中具有多方面的作用。以抗OPN抗体作为抑制剂,通过阻断OPN的作用,可达到缓解AS病变进展的目的。本研究为开发新的抗OPN制剂提供了实验依据
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R543.5

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