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《河北医科大学》 2003年
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白癜风与CTLA-4基因外显子1A/G~(49)多态性研究

张国强  
【摘要】: 目的:白癜风是一种以色素脱失为特征的常见皮肤病。白癜风的病因尚未明确,但存在许多假说可以解释白癜风的病因:神经化学因子学说,黑素细胞自身破坏学说和自身免疫学说。这些假说并不互相排斥,比较容易理解的是联合假说,即其他机制造成黑素细胞破坏之后,产生抗黑素细胞抗体,进一步引起自身免疫反应。有关白癜风免疫学方面的研究已有很多报道。白癜风的发病存在遗传易感性,超过20% 的患者有阳性家族史。有研究报道白癜风与特定的人类白细胞抗原(HLA)型别有关,但还未发现该病与MHC-Ⅰ类或Ⅱ类等位基因间有稳定的相关性。如果从某种程度上认为白癜风是一种自身免疫性疾病,那么造成自身免疫发生的遗传易感性因子或许影响白癜风的发病。 T淋巴细胞的免疫反应状态是由免疫刺激信号和免疫抑制信号之间相互作用决定的。一些自身免疫性疾病的研究发现:B细胞产生自身抗体有赖于CD4+T细胞的活化。研究证实,细胞毒T细胞相关抗原-4(CTLA-4)对活化的T细胞有抑制作用。CTLA-4位于人类染色体2q33,与CD28一样,是一种细胞表面分子,参与T细胞的调节。CTLA-4与CD28的共同配体是APC细胞表面的B7分子,其与CD28竞争B7配体,向T细胞传递负性信号,影响T细胞的增殖,细胞因子的产生和免疫反应。在CTLA-4基 WP=4 因敲除的小鼠模型中研究发现,小鼠体内T细胞在失去CTLA-4抑制作用后即形成过度增殖和活化,发展成致死性的自身反应性淋巴细胞增殖性疾病,显示CTLA-4在抑制T细胞过度激活中的作用。CTLA-4的基因变异或其表达障碍均可引起其功能改变,导致免疫负性调节作用减弱,可能引发自身免疫性疾病。而CTLA-4基因的多态性可能通过改变CTLA-4蛋白的表达或功能而导致个体自身免疫性疾病的易患倾向不同。目前已发现CTLA-4基因有3个多态性位点:启动子-318位点C/T多态性;外显子1第17密码子49位点A/G多态性;外显子4的3’非翻译区642位点的二核苷酸(AT)n可变重复序列。新近研究发现,CTLA-4基因多态性与一些自身免疫性疾病相关,表明CTLA-4基因或许是自身免疫性疾病的普遍易感性基因。有报道CTLA-4基因外显子1第49位A/G多态性与Grave's病和Ⅰ型糖尿病相关。目前国内外尚无白癜风与CTLA-4基因外显子1 A/G49多态性相关性的研究报道。由于白癜风与自身免疫性疾病密切相关,并且很可能就存在自身免疫,所以我们对CTLA-4基因外显子1第49位A/G多态性进行研究,欲探讨该多态性是否与白癜风的遗传易感性有关,并为进一步研究CTLA-4-Ig是否可应用于白癜风的临床治疗提供科学依据。 材料与方法:本实验采用病例-对照研究方法对白癜风与CTLA-4基因第1外显子 A/G49多态性的相关性进行研究。选取2001年12月至2002年9月在河北医科大学第四医院皮肤科门诊就诊的白癜风患者59例。诊断均根 WP=5 据患者的病史、临床表现和查体,并依据朱文元等提出的白癜风的诊断标准。其中男性患者24例、女性患者35例;患者年龄为9~66岁,平均为29岁;病期0.5~444月,平均为44月;进展期43例,稳定期16例;同时伴发其他一种或多种自身免疫性疾病者14例,不伴发其他自身免疫性疾病者45例。124例正常对照者为河北地区与患者无血缘关系的随机健康志愿者。其中男67例,女57例;年龄为18~60岁,平均年龄为30岁;均为汉族。在征得患者本人或其家属同意后,无菌操作下采集新鲜外周静脉血5 ml,采用Miller's蛋白酶K法提取基因组DNA。第1外显子序列设计上游引物为5'-GCT CTA CTT CCT GAA GAC CT-3',下游引物为5'-AGT CTC ACT CAC CTT TGC AG-3'。以基因组DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增CTLA-4基因外显子1(包含第49位多态性位点)。PCR反应体系及其循环参数参照有关文献,反应在PCR扩增仪中进行。具体反应体系为15 μl:灭菌去离子水9.2 μl, 10×PCR缓冲液1.5 μl,2 mmol/L dNTPs 1.5 μl,25 μmol/L 引物各0.3 μl, Taq酶(5 U/μl)0.2 μl,模板DNA 100ng。反应条件为:94℃预变性 5 分钟,以后按94℃变性 30 秒, 56℃退火 30 秒, 72℃延伸 40 秒,共进行35个循环,最后72℃再延伸5 分钟。用限制性内切酶BbvⅠ对PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性分析(RFLP),反应体系为12μl,其中BbvⅠ4U,底物DNA 8.8 μl,酶切条件为37℃水浴过夜消化;反应结束后,吸取上述消化产物上样于2.5% 琼脂糖凝胶电泳,同时上样阴性对照、阳性对照 WP=6 (多次实验确定的稳定的G/G纯合子的酶切产物),并选择合适分子量DNA标志物(Marker)平行电泳,溴化乙锭(EB)染色,在紫外灯下观察酶切结果。PCR产物电泳条带为162 bp;若扩增产物第49位碱基为A,则没有酶切产物;若扩增产物第49位碱基为G,则可见88 bp和74 bp的酶切产物。计算各基因型别、各等位基因频率,基因型及等位基因频率显著性检验分别用2×2、2×3行×列表χ2检验,显著性检验水准为0.05。 结果:对59例白癜风患者和124例正常对照者CTLA-4基因第1外显子A/G多态性进行基因分型。白癜风患者CTLA-4基因第1外显子第49位A/A纯合子者占13.6%,A/G杂合子占50.8%,G/G纯合子占35.6%;而正常对照组分别为17.7%,53.2% 和 29.1%;各组之间均无统计学差异(P>0.05)。白癜
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R758.41

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