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《河北医科大学》 2003年
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睾丸巨噬细胞对睾丸间质细胞功能和形态影响的体外研究

李菁菁  
【摘要】: 目的:本实验应用细胞培养、HE染色、组织化学染色、磁分离均相酶联免疫(磁酶免)睾酮定量测定法等技术方法,研究了经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活或未激活的睾丸巨噬细胞(testicular macrophage,TM)及腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM)对睾丸间质细胞(Leydig 细胞)的体外作用。主要观察不同浓度的巨噬细胞培养基(macrophag-conditioned media, MCM)在不同时间对Leydig 细胞分泌的基础睾酮的影响,以及对Leydig 细胞形态的影响,同时对巨噬细胞分泌的一种细胞因子-白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)的作用也进行了分析,以期进一步了解睾丸在生理及病理状态下TM与Leydig 细胞相互作用的机制,探讨睾丸生精微环境维持和紊乱的影响因素,为临床诊治免疫性不育提供参考。 方法:实验选用健康成年雄性Wistar大鼠,体重200g左右,分离得到睾丸巨噬细胞、腹腔巨噬细胞及Leydig 细胞,进行以下研究: 1 分别制备LPS(50μg/ml)激活24h的睾丸或腹腔巨噬细胞条件培养基(LPS-TMCM-24h、LPS-PMCM-24h)、LPS激活48h的睾丸或腹腔巨噬细胞条件培养基(LPS-TMCM-48h、LPS-PMCM-48h);同时制备未加 WP=4 LPS的TM及PM培养上清,分别得到TMCM-24h、PMCM-24h、TMCM-48h和PMCM-48h四种条件培养基。 2 每组分不同浓度(0%、5%、10%、20%、30%、40%和50%, 即MCM占24孔培养板每孔液体总体积的百分比)分别加入Leydig 细胞培养基内,并设立只加LPS的空白组(观察LPS对Leydig细胞有没有直接作用),24h后取上清,用瑞士雪兰诺Ⅰ型内分泌定量测定仪测量Leydig 细胞上清中的睾酮含量。确定巨噬细胞条件培养基的最佳刺激浓度。 3 按照以上得到的最佳浓度测定LPS-TMCM-24h在不同时间内(1h、6h、12h、24h、48h、72h, 即从加入LPS-TMCM-24h开始计时)对Leydig细胞上清睾酮含量的影响,确定最佳刺激时间;同时设立对照组(单独培养Leydig细胞,不加LPS-TMCM-24h)。 4 人重组IL-1β作为单独的影响因素,加入Leydig 细胞内,测量方法同上。 5 Leydig 细胞分两组,一组单独培养,一组加入LPS-TMCM-24h,应用计数法测定培养24h、48h、72h、96h和120h的Leydig 细胞的数量,比较两组细胞增殖的情况。 6 Leydig 细胞中分别加入LPS-TMCM-24h、LPS-PMCM-24h、TMCM-24h、PMCM-24h、IL-1和设立对照组,培养24h后进行HE染色。 7 部分Leydig 细胞培养于24孔板中的玻璃盖片上,分两组,一组作对照,一组加入LPS-TMCM-24h,培养24h后进行乳酸脱氢酶(LDH)染色。结果经计算机图象分 WP=5 析系统进行细胞阳性反应颗粒光密度(反映细胞内该酶的活性)测定。 8 所有结果经SPSS10.0统计分析软件进行统计学处理。睾酮值和细胞计数值多组间比较应用方差分析, 两组间细胞阳性反应颗粒光密度比较应用t检验。 结果: 1 分离细胞及纯度鉴定 1.1 总的睾丸间质内的细胞:经过Ⅰ型胶原酶及机械法的作用,大部分间质内的细胞都已经消化下来,而曲细精管保持完整,表面光滑,基本没有断裂。 1.2 TM:培养30min后TM迅速贴壁,呈圆形或椭圆形,细胞周边部可见小的突起,整个细胞中间稍厚,四周较薄,呈油煎蛋样。非特异性酯酶(NSE)染色鉴定阳性率达90%以上。 1.3 PM:培养30min后PM迅速贴壁,形态多样,有圆形、椭圆形、长梭形等,可能与其所处的功能状态不同有关。NSE染色阳性率95%以上。 1.4 Leydig细胞:培养24h后,活性良好的Leydig细胞大部分已贴壁,典型的呈多边形、三角形,核大,胞质呈均匀的细颗粒状,相差显微镜下可见为细小均一的脂滴。3β羟胆固醇脱氢酶(3β-HSD)染色阳性率达80%以上。 2 最佳刺激浓度的确定 2.1 LPS-TMCM-24h使Leydig细胞上清中睾酮含量增加,对Leydig细胞基础睾酮合成具有促进作用,其中LPS-TMCM-24h浓度为20%时达到最大值(0.412± WP=6 0.052ng/ml),与对照组(0.201±0.039ng/ml)比较P0.01,即20%为最佳刺激浓度。 2.2 LPS-PMCM-24h、TMCM-48h使Leydig细胞上清中睾酮含量减少,对Leydig细胞基础睾酮合成具有抑制作用。其中LPS-PMCM-24h 浓度为20%、30%、40%、50%时其睾酮含量分别为0.270±0.076, 0.310±0.032, 0.285±0.058, 0.256±0.108ng/ml与对照组(0.479±0.048ng/ml)比较P0.01;TMCM-48h浓度为5%、10%、40%时其睾酮含量分别为0.170±0.031, 0.180±0.043, 0.142±0.013ng/ml与对照组(0.247±0.054ng/ml)比较,睾酮含量明显降低(P0.05)。 2.3 TMCM-24h、PMCM-24h、LPS-TMCM-48h、LPS-PMCM-48h、PMCM-48h对Leydig细胞基础睾酮合成无明显影响,各浓度与对照组比较无明显差别(P0.05)。 2.4 IL-1β在浓度为12U/ml时抑制Leydig细胞基础睾酮合成的程度最大,加入12U/ml 的IL-1β时睾酮含量为0.394±0.071ng/ml,对照组为0.635±0.098ng/ml(P0.05)。 2.5 LPS单独影响:LPS对Leydig细胞基础睾酮合成无明显影响,各浓度(10%,20%,30%)组与对照组比较无明显差别(P0.05)。 3 最佳刺激时间的确定:从加入LPS-TMCM-24h开始计时到48h之前Leydig细胞上清中的睾酮逐渐增加,48h时达到最高值(0.455±0.055ng/ml),48h后开始下
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R329

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