NO在挤压大鼠双后肢致急性局部肌组织和远隔器官（肝脏、肺脏）损伤中的作用

【摘要】： 目的：广泛软组织损伤为法医学实践所常见，且以臀部及双下肢损伤为主，其损伤特点是局部损伤貌似轻微，全身性继发性病理变化隐匿，后果严重，常导致远隔器官包括肾脏、心脏、肺脏、肝脏等的严重损伤，直至发生创伤性多器官功能不全综合症（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。其发生机制至今尚不完全清楚。本研究室已经成功的复制出挤压复合内毒素造成动物MODS的动物模型，发现双后肢挤压伤导致远隔器官如肝脏、肾脏、肺脏等功能障碍，并伴随抗氧化能力下降，多种炎症介质和细胞因子（如TNF-α、IL-1）是促成这种器官损伤的物质基础。一氧化氮（nitric oxide，NO）系一种新颖的气体信使分子，具有多向性调节作用，同时又是一种自由基，化学性质十分活泼。一氧化氮由一组一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L-精氨酸氧化生成，NOS主要有诱导型（iNOS）和固有型（cNOS）两类。严重创伤应激、细胞因子可诱导iNOS表达或调节 cNOS活性，改变NO的生成与功能。NO在机体病理过程中的作用十分复杂，可由于作用时间、器官、剂量等差异而具有保护和／或损伤的作用，因而有双刃剑之称。严重双后肢挤压伤致局部及远隔器官NO和NOS的变化规律及其意义尚不清楚。本实验通过挤压双后肢致远隔器官损伤模型， WP=5 尝试探讨NO在局部肌肉组织和远隔器官（肺脏、肝脏）损伤中的作用。 方法：健康Wistar大鼠55只，体重160±20g，雌雄不拘，实验前12 h禁食，自由饮水。大鼠俯卧位固定于木板上，于双后肢上压15kg的标准重物，连续挤压5 h后释放动物，任其自由活动，观察5h后大鼠在全麻下行腹部切开术，从腹主动脉采血液。经腹主动脉快速放血处死，收集检材待检。大鼠随机分成4组（1）对照组（S组），（2）挤压组(C组)，（3）挤压加氨基胍组(A组)，（4）挤压加L-精氨酸组（L组）。S组除不挤压外，其余处理同挤压模型。C组处理同挤压模型。A组在挤压5h松开时舌下静脉注入氨基胍（AG）10 mg/kg bw。L组在挤压5h松开时舌下静脉注入L-精氨酸 (L-Arg) 150 mg/kg bw。实验首先探讨局部NO在严重挤压大鼠双后肢致局部肌组织继发性损伤中的作用，并检测血浆中NO含量和NOS活性。从腹主动脉采集血液约2ml，离心后吸取上层血清；大鼠放血处死后，留取局部肌肉组织约200mg，制备10%肌组织匀浆。用生化方法检测血清和肌组织NO含量和NOS活性；留取局部肌肉组织适量制做病理切片、观察形态学变化及进行iNOS、eNOS免疫组化检测；另留局部肌肉组织测湿干重比值。其次探讨严重挤压双后肢致远隔器官（肺脏和肝脏）损伤和与NO变化的关系。从腹主动脉采集血液约4 ml做血气分析和肝功能检测；留取肺脏、肝脏检材各3份，分别作病理切片、观察形态学变化和iNOS、eNOS免疫组化、检测NO含量、NOS活性和组织的湿干重比值。 结果： WP=6 1 挤压双后肢致局部肌肉组织损伤及NO、NOS变化 1.1 局部肌组织损伤 肌肉湿干重比值（W/D）变化 S组W/D为3.90±0.16，C组W/D为4.74±0.22，明显高于S组(P0.01)。A组、L组W/D分别为4.5±0.25、5.3±0.38。与C组比较A组W/D降低（P0.05），L组W/D明显升高（P0.01）；与 A组比较，L组W/D明显升高（P0.01）。 肌组织的病理变化 S组 肌纤维结构清楚，未见出血、坏死等改变。C 组 肌纤维肿胀，横纹不清，可见肌纤维溶解，间质水肿，可见小动脉充血和小静脉淤血及肌纤维间出血。A 组 肌纤维肿胀似有减轻，可见断裂及肌纤维溶解，间质水肿减轻，小动脉充血和小静脉淤血较C组减轻。L组 肌纤维肿胀加重，可见断裂，肌浆横纹不清，可见肌溶解，嗜伊红染色不均， 内可见空泡，肌浆凝聚与溶解相间，间质水肿较C组加重，小动脉充血和小静脉淤血及肌纤维间出血较C组加重。 1.2 局部肌肉组织NO含量、NOS活性变化 局部肌肉组织NO含量：S组NO含量为37.24±3.35μmol/g prot，C组NO含量为55.49±6.35μmol/g prot，明显高于S组(P0.01)。A组、L组NO含量分别为39.49±6.18μmol/g prot、71.34±6.29μmol/g prot。与C组相比较A组NO含量降低（P0.01），L组NO含量升高(P0.01)。 局部肌肉组织NOS活性: S组NOS值为10.97± 0.53U/mg prot，C组NOS值为16.41±0.85U/mg prot，明显高于S组（P0.01）A组、L组NOS值为分别为13.39 WP=7 ±0.64U/mg prot、15.12±0.73U/mg prot。与C组相比较，A组NOS值降低（P0.01）、L组NOS值无明显变化（P0.05）。 1.3 局部肌肉W/T与肌肉NO含量变化的相关分析 各组肌组织NO值与W/T值均呈明显正相关。S组相关系数为0.926（P0.05）；C组相关系数为0.992（P0.01）；A组相关系数为0.925（P0.05）；L组相关系数为0.892（P0.01）。 1.4 局部肌肉组织eNOS和iNOS蛋白表达免疫组化检测 局部肌肉组织eNOS蛋白表达免疫组化检测：S组肌肉组织可见血管内皮细胞和骨骼肌纤维有黄棕色的eNOS信号其中内皮细胞eNOS信号较强；C组血管内皮细胞和骨骼肌纤维中黄棕色的eNOS信号明显增强，以内皮细胞增强为明显；A组、L组血管内皮细胞和骨骼肌纤维中黄棕色的eNOS阳性信号与C组比较无明显差异。 局部肌肉组织iNOS蛋白表达免疫组化检测：S组骨骼肌纤维?