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《河北医科大学》 2003年
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饲养层对小鼠胚胎干细胞生长特性的影响

廖素彬  
【摘要】: 目的:胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ES细胞)是从附置前早期胚胎内细胞团(ICM)或 附置后原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)分离克隆出来的一种具无限增殖能力和全向分化能力的干细胞。具有无限增殖和分化的潜能,在体外培养的条件下,加入饲养层或某些分化抑制因子,诱导分化因子,可以诱导其向特定的细胞方向分化,应用于基础实验研究或临床疾病治疗。Sertoli细胞可以分泌干细胞生长因子(SCF),而SCF对ES细胞有显著的分裂作用,能诱导干细胞进入细胞周期,提高转基因效率,而且SCF是干细胞生长的唯一调控因子,能控制胚胎发生过程中发育不同阶段的蛋白。另有报道认为SCF能通过抑制细胞凋亡而促进细胞的生长,可提高ES细胞培养和建系速率,为建立ES细胞系提供可靠基础。鉴于此,本项研究拟采用细胞培养、免疫组化、MTT分析等方法建立起稳定的小鼠成纤维细胞饲养层及Sertoli细胞饲养层,在此基础上,进行ES细胞的分离、培养,以比较Sertoli细胞饲养层和成纤维细胞饲养层的增殖生长情况及两种饲养层对ES细胞形态及生物学特性的影响。 材料和方法:1原代成纤维细胞及Sertoli细胞 WP=4 的分离培养 选取昆明孕鼠( 13.5-14.5dpc),分离胎鼠的表皮成纤维细胞,0.25%胰酶消化,37℃15min,低速离心,用含10%FCS的DMEM高糖培养基重悬细胞,调整细胞浓度,接种于培养瓶。选取16天左右的雄性小鼠5只,取其睾丸,去白膜,剪碎,0.25%胰酶及0.1%胶原酶消化,过200目网,低速离心,用含10%FCS的DMEM高糖培养基重悬细胞,调整细胞浓度,接种于培养瓶。2取长满单层细胞的盖玻片,进行HE染色,Giemsa染色,及免疫组织化学的方法检测Actin抗体在成纤维细胞和Sertoli细胞的表达情况。每种细胞分别选取3张切片,每张切片随机选5个视野,计数总细胞数和阳性细胞数,计算免疫组化阳性率,结果进行统计学处理。MTT法测生长曲线,以时间为横坐标,吸光度为纵坐标作生长曲线,比较两种细胞的生长情况。3饲养层的制备 取生长良好的成纤维细胞及Sertoli细胞,吸掉培养基,加入新鲜配制的含10μg/ml丝裂霉素C的DMEM培养基,37℃孵育2.5-3小时。胰酶消化制备单细胞悬液,接种在明胶处理的四孔板。4 ES细胞的分离培养 取3.5-4.5dpc的孕鼠,剪开腹腔,用镊子夹取子宫角顶端,用圆头注射器吸取少量冲胚液,从一侧子宫角顶端注入冲胚液轻轻冲洗子宫角,用凹皿收集胚胎,移植入有饲养层的的四孔板中。4-5天后,将附着于培养皿底壁的生长良好、未分化现象的鸟巢状的小鼠内细胞团用灭菌玻璃针拨动,使其与滋养层细胞 WP=5 和成纤维细胞分离。再用消化液离散成小细胞团块,移入新制备的成纤维细胞和Sertoli细胞饲养层上,在37℃,5%CO2饱和湿度的CO2培养箱中孵育。5 ES细胞进行碱性磷酸酶染色,分别测定成纤维细胞和Sertoli细胞饲养层上ES细胞的生长曲线。并进行统计学处理。 结果:1成纤维细胞及Sertoli细胞的生长状况及鉴定 成纤维细胞接种半小时后贴壁,可见细小突起长出,细胞呈梭形,核圆形。24小时后即可连生。刚刚分离出来的Sertoli细胞呈圆形,细胞贴壁后,可见Sertoli细胞伸出许多长的突起,细胞之间镶嵌排列。细胞呈大三角形或不规则形,核大而圆,核中央有1-2个大而明显的核仁。Sertoli细胞最突出的特征是胞质内可见透亮脂滴。 2 HE染色 成纤维细胞均匀分布,呈梭形,突起较长,核蓝紫色,核内可见染色质散在分布,胞质粉红色。Sertoli细胞稀疏分布,呈扁平多突起状,突起较短,核蓝紫色,核大而圆,核仁清楚,多为两个,胞质染色较浅,呈泡沫状。 Giemsa染色 成纤维细胞形态如上,核红色,胞质蓝色。Sertoli细胞形态如上,核呈红色,核内可见圆形卫星小体,位于核仁附近,直径较小,胞质紫色。 3 Actin免疫组化染色 Actin阳性反应呈棕黄色颗粒,分布于胞质内。成纤维细胞内未见棕黄色颗粒分布。Sertoli细胞胞质有大量棕黄色颗粒分布,阳性反应明显。统计结果显示 Sertoli细胞Actin免疫组化阳性率高于成纤维细胞, WP=6 二者比较有显著差异(P0.01)(见Table1 Fig.1)。 两种细胞生长曲线呈逐渐上升趋势,开始阶段成纤维细胞生长速度高于Sertoli细胞,5天后渐缓。而Sertoli细胞曲线呈缓和上升趋势,5天后仍继续上升, 统计学处理未见明显差异(P0.05)。(见Table2 Fig.2)4 小鼠囊胚的生长行为 收集到的囊胚在培养(2-20)小时后,胚腔扩大,ICM集中于胚的一侧,绝大部分胚已脱去透明带,先后贴壁,附着在饲养层细胞表面,滋养层的细胞逐渐长出,推开饲养层细胞,同时ICM也开始增殖,培养4-5天后,ICM增大为圆柱样结构,其中有一小部分胚胎贴壁后增殖较小,不形成卵圆柱状结构。5 ES细胞生长状况 ES细胞集落样生长,集落边缘光滑清晰,有的集落边缘可见小的散在的ES细胞。细胞呈团状排列,每个细胞呈圆形,部分呈梭形,体积小,核大,胞浆少,可见一个或多个核仁。以成纤维细胞为饲养层的ES细胞,接种后集落呈圆形,较密集,集落周围有较多的小的ES细胞团或单个的ES细胞。细胞呈团状排列, 每个细胞呈圆形,部分呈梭形,体积小, 核大, 透亮。随培养时间的延
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R329

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