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急性心肌梗死及模拟心肌缺血对心室肌细胞离子通道活性的影响

齐书英  
【摘要】: 急性冠脉综合征心肌缺血发作时可发生各种心律失常,特别是室性心律失常,是急性心肌梗死早期最严重的并发症之一,也是发生心源性猝死的主要原因。临床电生理研究发现,急性冠脉堵塞后,缺血和梗死区心肌内部、缺血和梗死区与周围供血正常或相对正常的心肌之间存在电生理的不均一性即电生理的异质性,容易形成折返和后除极,在室性心律失常的发生和维持上起着关键作用,但缺血相关的室性心律失常发生的细胞分子学机制尚未见系统研究。国外有学者应用膜片钳全细胞记录方法研究了急性心肌梗死后心肌细胞离子通道的变化,但缺乏系统全面的研究,尤其是冠脉急性闭塞的最初24小时内缺血区心肌细胞离子通道的变化如何尚未见文献报道。国内自90年代开始利用膜片钳技术进行了电生理学和电药理学研究,但关于急性心肌梗死后心肌细胞离子通道的变化,尚无相关的研究报道。心室中层细胞及心室跨壁电生理异质性是近年来心脏电生理领域的重点研究方向之一,但跨壁电生理异质性的细胞分子学基础尚未完全明了,而急性缺血对心室肌跨壁离子通道异质性的影响尤其是对心室中层细胞的影响则罕有研究报道。 膜片钳技术是当今国际公认的细胞电生理研究的前沿技术,它的发明使直接研究细胞膜的离子通道电流特性成为现实。本课题利用全细胞膜片钳技术,旨在研究兔急性冠脉结扎1小时的缺血区及急性心肌梗死1周后的梗死区心外膜心室肌细胞快钠通道电流(INa)、L型钙通道电流(ICa-L)和瞬间外向钾电流(Ito)活性的变化,探讨离子通道电流的这些变化在急性冠脉结扎及急性心肌梗死后发生快速性室性心律失常的意义。另外,本研究还利用膜片钳技术,直接测定了左室游离壁三层心肌细胞即心外膜层(Epicardium, Epi)、心室中层(Midmyocardium, M)和心内膜层(Endocardium, Endo)心肌细胞的INa和Ito活性,并通过改变细胞外灌流液的成分(即无葡萄糖、加乳酸钠、 WP=5 降低pH值和充以氮气)以模拟急性心肌缺血缺氧,系统观察了模拟心肌缺血30分钟内不同时间点(10分钟,20分钟和30分钟)这两种通道电流特性的变化,目的在于了解心室跨壁电生理异质性的细胞学基础及其急性心肌缺血对心室跨壁电生理异质性影响的离子通道机制,以期为缺血相关的室性心律失常的治疗提供理论依据。 本研究的实验动物均为健康的新西兰大耳白兔,体重1.5~2.0kg,雌雄不限,购自华北制药集团实验动物中心,检疫合格。 本研究共分五部分。 第一部分: 急性心肌梗死对心室肌细胞钠电流活性的影响 材料与方法:健康新西兰大白兔22只,随机抽取12只兔用于建立急性心肌梗死动物模型,5只兔作为假手术对照组,另外5只兔作为正常对照组。采用开胸结扎兔冠状动脉左前降支的方法建立急性心肌梗死动物模型,1小时(冠脉结扎1小时组,6只兔)或1周(心肌梗死1周组,6只兔)后处死动物。假手术对照组(5只兔)开胸后仅分离冠状动脉左前降支并穿线,但不结扎血管。正常对照组不进行任何干预。利用胶原酶酶解法分离结扎冠脉供血区(即缺血或梗死区)心外膜层单个心室肌细胞,制备成单细胞悬液。冠脉结扎1小时和急性心肌梗死1周组细胞来源于冠状动脉左前降支供血的左心室前壁缺血区或梗死区(梗死及周边2 mm)部位,正常对照组和假手术对照组细胞则取自正常对照组兔与缺血或梗死区相对应部位的心室肌。以常规方法进行细胞封接形成全细胞膜片钳记录模式,记录兔冠脉结扎1小时的缺血区及心肌梗死1周后的心外膜梗死区心肌细胞INa电流,包括INa电流密度-电压关系曲线(I-V曲线)、稳态失活曲线及失活后再恢复曲线,并与正常对照组进行比较分析。电流记录的刺激程序由pulse+ pulsefit 8.53软件控制,通道信号经EPC-9膜片钳放大器放大,通过Ag/AgCl电极丝和填充电极内液的玻璃微电极导入细胞,产生的电流信号经EPC-9放大器转换,由pulse+ pulsefit软件采集保存。应用SPSS 10.0软件包进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,首先进行组间均衡性检验,两组计量资料采用t检验,成组资料间比较采用方差分析,以P0.05为有显著性差异的标准。 结果:①冠脉结扎1小时组、急性心肌梗死1周组与对照组相比, WP=6 INa I-V曲线上移,但INa电压依赖性不变,即冠脉结扎和急性心肌梗死对心肌细胞钠电流的激活电位、峰值电位、反转电位及I-V曲线的形态轨迹均无显著影响。三组细胞的INa均在-50mV激活,-20mV达峰值,+50mV时反转。INa峰值电流密度(-20mV)对照组为-12.23±3.33pA/pF(n=12 cells),冠脉结扎1小时组和心肌梗死1周组较对照组显著下降,分别为-5.35±2.43pA/pF(n=10 cells)和-6.81±2.62 pA/pF(n=14 cells),较对照组分别平均下降了55.98%和44.00%,P0.001和P0.01;与急性心肌梗死1周组相比,冠脉结扎1小时组INa峰值电流密度下降更明显,P0.05。②冠脉结扎1小时组、急性心肌梗死1周组与对照组相比,INa稳态失活曲线明显左移(即向超极化方向移动),以冠脉结扎1小时组左移更加明显。半数最大失活电压(V0.5)对照组为-76.2±5.3mV(n=10 cells),冠脉结扎1小时组为-100.0±5.6mV(n=8 cells),与对照组比较有非常显著的差异,P0.001;急


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