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《河北医科大学》 2004年
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抗CD44粘附分子单克隆抗体对HL-60白血病细胞增殖及分化的影响及其机制探讨

郝洪岭  
【摘要】:目的:急性髓细胞性白血病(AML)是一种异质性很强的恶性克隆性疾病,表现为白血病性原始细胞异常增生,导致髓系细胞的成熟分化受阻,从而构成了不同的AML亚型。AML的治疗关键是杀灭患者体内增殖的白血病细胞。由于白血病细胞对化疗药物产生抗性(MDR),因此单纯化疗很难根除恶性细胞克隆。上世纪70年代Sachs率先提出了“分化治疗”的概念,80年代中期我国学者首创全反式维甲酸(ATRA)诱导分化治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)获得成功,显著提高了患者生存质量。然而,现有的分化诱导剂ATRA及三氧化二砷(As_2O_3)等仅限于治疗APL,对其它大部分AML几乎无效。因此,有关白血病细胞的分化机制、诱导分化治疗策略以及开发新型诱导分化剂一直是血液学领域的研究焦点。CD44是属于粘附分子家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白,广泛存在于大多数脊椎动物的细胞表面,介导细胞与细胞或细胞与细胞外基质之间粘附作用,参与细胞信号转导与活化、细胞的生长分化、肿瘤的进展和转移、免疫应答、凝血等诸多生理、病理过程。CD44分子表达于大多数骨髓CD34~+细胞及系别限制性造血祖细胞上,参与髓系正常分化。CD44的功能阻断性抗体可抑制髓系造血生成。有报道(1999),CD44粘附分子高表达于所有AML亚型原始细胞上,CD44的激活性抗体或其天然配体透明质酸(HA)与细胞表面CD44结合可诱导各型AML患者原始细胞分化;体外研究也发现,CD44单克隆抗体能够不同程度地抑制多种髓系白血病细胞株的增殖并诱导细胞分化或凋亡。由于CD44粘附分子表达于细胞表面,极易接受细胞外界环境的刺激,而且参与髓系造血生成及血细胞正常分化;同时,CD44作为信号发放分子介导跨膜信号级联反应,通过调控某些癌基因、转录因子、细胞生长因子及其受体基因、酶及细胞结构蛋白基因的表达而影响细胞的生物学功能。因此可以预测,CD44有可能成为白血病分化诱导治疗的一个新靶点。然而,有关CD44分子诱导白血病细胞分化的机制尚不太清楚。本研究以人HL-60细胞株为白血病细胞模型, 中文摘要 观察CD44单克隆抗体A3DS对急性髓系白血病细胞增殖、分化的影响效 应,探讨CD44分子途径的作用机制,希望能为白血病的诱导分化治疗提 供一条新思路。 方法:1细胞培养及CD44结合反应将人AML一M:型细胞系HL一60 培养于含体积分数为15%的灭活胎牛血清、100U/ml的青霉素和100林留ml 硫酸链霉素的即Ml 1 640培养液中,置37 OC、体积分数为5%的二氧化碳 的培养箱中培养,每2一3天传代一次,实验用对数生长期细胞,台盼蓝 染色拒染率均在95%以上。将密度为1 x 105/ml的HL一60细胞悬液接种在 96孔平底培养板,每孔200川,分别加入不同浓度的抗cD44单克隆抗体 (克隆号A3DS,鼠IgGI),常规培养6天,于不同时间收集细胞用于实 验。所有实验同时用相同浓度的同型对照抗体(小鼠lgGI)作为对照组。 2抗CD44单抗A3DS对HL一60细胞增殖活性的影响 2.1 MTT实验将1 x 10勺ml细胞悬液接种在%孔平底培养板,每孔200 抖l,分别加入终浓度为0.3、0.6、1 .2和2.4协留ml的A3DS进行孵育。每 个浓度接种3个复孔,培养1一6天。培养结束前6小时每孑[加入20闪MTT 溶液,离心弃上清,加入200川二甲基亚飒(DMSO)充分溶解结晶物, 酶标仪测490nm处吸光度A值,绘制细胞生长曲线并计算增殖抑制率。 2.2台盼蓝活细胞计数如上法将浓度为2拼g/ml的A3DS与培养细胞共孵 育,连续6天,每天取适量细胞悬液混匀,0.25%台盼蓝染色,计数拒染 的活细胞数并绘制生长曲线。 2.3 FeM检测en71表达收集A3DS(2“g/m一)孵育72小时的陇一60 细胞l只104个,加入10林1 FITe偶联的en71抗体,4oc避光放置30分 钟,冷PBS洗涤后FCM检测CD71阳性细胞百分比。 3抗CD44单抗A3DS对HL一60细胞髓系分化的影响 3.1 FCM检测系别抗原表达变化分别收集A3DS及对照抗体孵育的细胞 并调整为sxlo,/ml,取细胞悬液各100川,分别加入PE或FITc偶联的 抗CDI lb、eD14、Co15单抗10林l,4oC避光放置30分钟,冷pBs洗 涤后FCM检测各分化抗原表达阳性率。 3.2光学显微镜细胞形态观察于不同时间收集A3DS孵育的HL一60细胞, 离心制片后wright一Giemsa染色,光镜下观察细胞形态学变化。 3.3 NBT还原试验取A3os作用的讯一60细胞2 x 10,个,悬浮于700抖l 2 中文摘要 即Ml 1 640培养基中,加入终浓度为50抖g/ml TpA、0.05%NBT溶液,37 ℃孵育30分钟;4℃终止反应,PBs洗涤后离心涂片,Wright一Giemsa染 色,光镜下观察200个细胞,计算NBT阳性细胞百分率。 3.4 RT一PCR检测G一CSF表达收集对照及A3DS作用48小时的HL一60 细胞,以Trizol RNA试剂盒提取细胞总RNA,以M一MLV反转录酶合成 eDNA。G一CSF正义引物为:5’一TTGGACACACTG CAGC TGG ACGTCGCCGACTTT一3’,反义弓}物为:5’一ATTGCAGAGCC AGGGCTG GGGAGeAGTeATAGT一3’,扩增片断长度47obp;p一aetin正义引物为: 5,一ACGAAACTACCTTCA ACTCCATCAT一3’,反义引物为: 5’一CTAAGTeATAGTCCGCCTAGAAG CA一3’,扩增片段长度为3
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R733.7

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【参考文献】
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