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《河北医科大学》 2004年
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IL-15表达质粒联合HPV基因疫苗诱导细胞免疫应答的实验研究

孙欣  
【摘要】:目的:人类乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV) 感染人的皮肤和粘膜上皮细胞,与上皮细胞的良性与恶性增生密切相关。HPV的一些亚型可以引起皮肤疣、尖锐湿疣等良性增生性病变;而另一些亚型可以引起宫颈癌及其它生殖器肿瘤、皮肤肿瘤、口腔肿瘤等。由于缺乏特异的有效治疗手段,HPV感染严重影响人类的健康,因此急需研制安全有效的疫苗。HPV目前尚不能在体外大量培养,难以研制传统疫苗。基因疫苗具有制备简单、免疫应答持久、安全稳定、可反复使用等优点,是一种有前途的新型疫苗。HPV16的早期蛋白基因E7基因是基因疫苗的理想靶抗原,研究表明HPV16 E7疫苗可以诱导动物产生特异性细胞免疫应答和体液免疫应答,保护小鼠不受HPV16阳性肿瘤细胞的攻击,并且能抑制已经形成的肿瘤的生长甚至使肿瘤消退。但是当该疫苗应用于灵长目动物时,其免疫原性降低;在人体中应用该疫苗,其诱发的免疫应答更为减弱。而疫苗最终要应用于人体,因此必须进一步提高疫苗的免疫原性。研究发现某些细胞因子基因与基因疫苗共同注射,可以提高基因疫苗的免疫效果。白细胞介素-15(Interleukin-15, IL-15)为一种最近发现的细胞因子,可以共享白细胞介素-2(Interleukin-2, IL-2)的受体和活性,例如:激活T细胞,特别是CD8+CTLs。除 WP=4 了具有IL-2活性外,它还在NK细胞的活化和其功能的调控中起关键作用。IL-15基因已经在一些实验中被用作基因疫苗佐剂,取得了良好的促进抗原特异性免疫应答的效果。但是还没有它对HPV16 E7基因疫苗免疫效果影响的报道,因此本实验亚克隆了IL-15基因,构建了其真核表达质粒,与HPV16 E7基因疫苗共同注射于BALB/c小鼠,并观察其对小鼠的特异性细胞免疫应答的影响。 方法:用EcoRI、BamHI双酶切pGEM-T-IL-15质粒,以Sliver Beads胶回收试剂盒酶回收500bp酶切产物IL-15,与同样经EcoRI、BamHI双酶切的pcDNA3.1在DNA连接酶的作用下连接,构建真核表达质粒pcDNA3.1-IL-15。连接产物转化感受态大肠杆菌DH-5α,于LB培养基中过夜培养,小量提取质粒,经EcoRI、BamHI双酶切鉴定连接产物,选择阳性克隆进行质粒大量提取并纯化,测OD260和OD280进行定量和纯度检测。pcDNA3.1-E7、pcDNA3.1同样经转化、小量提取、双酶切鉴定、大量提取、纯化和定量。各种质粒用生理盐水(normal saline, N.S.) 稀释至所需浓度,用于动物免疫。雌性BALB/c小鼠,6周龄,随机分为6组,分别肌肉注射接种N.S.、pcDNA3.1、pcDNA3.1-E7、pcDNA3.1-E7+pcDNA3.1、pcDNA3.1-E7+pcDNA3.1-IL-15和pcDNA3.1-IL-15。每只100ug,混合接种组每种质粒各100ug。接种前以25%高渗蔗糖溶液100ul预处理接种部位。2周后以同样剂量加强免疫,共加强免疫3次。末次免疫1周后取血并分离血清,双抗夹心ELISA法测定IFN-γ;无菌取脾,制备脾淋巴细胞悬液,加入到96孔培养板中,每孔含5×105个脾细胞,并分别加入E7蛋白和RPMI1640+10% WP=5 灭活小牛血清,MTT法做T淋巴细胞增殖实验,以OD570值之差代表T淋巴细胞增殖程度。组间比较采用单因素方差分析,显著性检验水准α=0.01。 结果: 构建的pcDNA3.1-IL-15重组质粒经酶切得到500bp的基因片段,与pGEM-T-IL-15酶切得到的基因片段大小相等;pcDNA3.1-E7重组质粒经酶切得到300bp的基因片段与目的基因片段理论值大小相等。经pcDNA3.1-E7免疫小鼠的血清中可以检测到IFN-γ浓度为150.4pg/ml,而生理盐水组和空质粒组均未检测到IFN-γ。pcDNA3.1-IL-15与 pcDNA3.1-E7共同注射,可以提高免疫小鼠血清中IFN-γ水平至414.1pg/ml,与E7+空质粒组、E7组比较差异有显著性(P0.01)。IL-15组没有检测到IFN-γ。经pcDNA3.1-E7免疫小鼠的脾淋巴细胞出现了特异性T细胞增殖反应,OD570差值为0.644,生理盐水组和空质粒组分别为0.228、0.322,E7组与生理盐水组和空质粒组之间差异均有显著性(P0.01)。pcDNA3.1-IL-15与 pcDNA3.1-E7共同注射,可以增强特异性T细胞增殖反应,OD570差值为1.313,与其他各组比较差异均有显著性(P0.01)。 结论:1 本研究成功地构建了人白细胞介素15基因重组真核表达质粒pcDNA3.1-IL-15。2 用pcDNA3.1-E7免疫小鼠可以诱导小鼠特异性T淋巴细胞的增殖,血清中可以检测到IFN-γ。说明pcDNA3.1-E7具有免疫原性,可以诱导小鼠细胞特异性免疫应答。3将pcDNA3.1-IL-15与pcDNA3.1- E7共同注射于BALB/c小鼠,可以增强小鼠特异性T淋巴细胞的增殖,并且血清中IFN-γ水平提高。pcDNA3.1-IL-15可以提高HPV16 E7基因疫苗免疫原性,增强小鼠细胞特异性 WP=6 免疫应答。IL-15基因是一种优良的HPV16 E7基因疫苗的基因佐剂。
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