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《河北医科大学》 2004年
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罗格列酮对糖尿病大鼠肾脏过氧化物酶体增殖激活受体γ表达作用的研究

张涛  
【摘要】:目的: 糖尿病肾病(DN)是一种糖尿病常见和严重的慢性并发症,它已成为终末期肾功能衰竭(ESRF)的主要原因之一,因而探索糖尿病肾病的发病机制及其防治方法是当今肾病学者热切关注的课题。过氧化物酶体增殖激活受体 (PPARs)是一类由配体激活的核转录因子,属于Ⅱ型核受体超家族成员。PPARs与配体结合后,与视黄酸类受体(RXR)形成异二聚体,然后与所调节基因的启动子上游的过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)结合而发挥转录调控作用。到目前为止,已发现PPARs有α、β/δ、γ三种基因型,研究报道PPARγ与脂肪细胞的分化,糖脂类代谢及胰岛素抵抗关系密切,其可在以脂肪组织,结肠为主的多种组织、细胞中表达。PPARγ还具有抑制血管平滑肌细胞的增生和迁移;调节巨噬细胞中促炎症因子的转录等多种生物学效应。近期研究证实肾小球和体外培养的系膜细胞(MC)均可表达功能性PPARγ,推测PPARγ有可能成为DN治疗的新靶点。 噻唑烷二酮类药物(TZDS),包括罗格列酮,曲格列酮等,是PPARγ的重要合成型配体,属一类新型的胰岛素增敏剂。它在降低血糖、改善糖耐量、脂质代谢及高胰岛素血症方面均有显著效果。临床已应用于2型糖尿病及相关代谢紊乱的治疗,并收到了确切疗效。晚近有研究指出TZDS可以降低STZ诱导的1型糖尿病大鼠的尿白蛋白排泄率,抑制肾小球 WP=4 胞外基质的增多,但不影响其血糖水平。在非胰岛素依赖的糖尿病大鼠模型和5/6肾切除动物模型中,也发现了类似的效应,由此提示TZDs可能直接作用于肾脏的PPARγ靶点,发挥肾脏保护效应,并不依赖于其增敏胰岛素的特性,但其确切的作用机制尚未完全阐明。这也正是我们的实验所要探讨的关键所在。 本课题应用实验性糖尿病大鼠模型和高糖培养系膜细胞,分别从整体和细胞水平观察PPARγ在DN中肾脏的表达及活性变化,以及TZDS类药物罗格列酮对 PPARγ、与系膜细胞功能、肾脏病理变化密切相关的基因表达的影响,探讨其不依赖于降糖效应,保护肾脏的部分作用机制;为临床早期药物干预治疗人类DN提供实验性理论依据。 方法:1.体外培养大鼠系膜细胞,分为三组,即正常对照组,高糖刺激组及罗格列酮干预组,分别于12、24、48h后用MTT法观察经高糖刺激和应用PPARγ配体后的细胞增殖变化情况,用免疫细胞化学方法检测系膜细胞中PPARγ、c-Fos、c-Jun的表达。2.选择健康雄性SD大鼠36只,随机抽取10只作为正常对照,其余26只给予STZ 60mg/kg腹腔注射,制成糖尿病模型,再随机分为糖尿病组及罗格列酮治疗组,分别于4、8周末称重,收集24h尿,处死动物留取血清及肾组织,称肾重,分别测定血糖、血肌酐、尿肌酐、尿蛋白浓度,并计算24小时尿蛋白排泄率,肌酐清除率及肾重/体重。肾组织行PAS染色,光镜观察,计算肾小球细胞外基质相对面积;电镜下观察肾组织超微结构变化。应用免疫组化的方法分别检测肾皮质中PPARγ, TGF-β1,Ⅳ型胶原蛋白的表达, 结果进行半定量图像分析;流式细胞仪测定 WP=5 肾皮质PPARγ的蛋白表达情况。 结果:1.细胞培养结果:高糖组12h、24h、48h时MTT试验OD值均较正常组明显升高(p0.01),尤以12 h最为显著,48h时较前两个时间点有所下降,而罗格列酮干预组各时点的OD值较高糖组显著降低(p0.01) ; 高糖组PPARγ蛋白水平在12h已较正常组明显下降(P0.05),而罗格列酮干预组其表达较高糖组有所上调(P0.05);高糖组c-Fos于12 h、24 h表达均明显高于正常对照(p0.01),而在48h其表达水平与正常无明显差异; c-Jun在三个时点的表达均高于正常对照,罗格列酮干预组c-Fos,c-Jun的蛋白表达水平均较同时期高糖组明显降低(P0.05)。2.动物实验结果:第4、8周末,治疗组肌酐清除率,24h尿蛋白排泄率及肾重/体重均低于同时期糖尿病组(p0.01),而其血糖水平组间无差异(p.05),但两组均明显高于正常组(p0.01)。免疫组化及流式细胞术检测的结果显示糖尿病大鼠肾皮质PPARγ表达降低显著(P0.01), 治疗组其表达较模型组有所上调(P0.05)。通过免疫组织化学染色可以看到糖尿病大鼠肾皮质TGF-β1和Ⅳ型胶原表达明显增加(P0.01), 且随病程延长而逐渐加重,在治疗组上述增加的表达均受到明显抑制(P0.05)。 光镜下模型组系膜外基质进行性增加,可见肾小球肥大,肾小管空泡变性; 电镜下基底膜不均匀增厚,足突融合,窗孔结构消失等病理改变明显,治疗组上述异常变化明显减轻。 结论: PPARγ在糖尿病大鼠肾小球或高糖环境下的系膜细胞中表达均是减少的,同时伴有c-Fos,c-Jun表达升高, 以及TGF-β1及ECM成份IV型胶原蛋白水平的上调。罗格列酮可以提高DN时肾脏局部PPARγ的表达,抑制c-Fos,c-Jun WP=6 的合成,从而抑制细胞增殖,下调TGF-β1及ECM的表达,改善肾功能及肾组织病理变化,阻止和延缓病变进展。因而TZDs可能具有直接肾脏保护作用,并不完全依赖于其调节糖脂代谢的特性。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R587.1

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