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《河北医科大学》 2004年
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基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在糖尿病小鼠视网膜组织中的表达

于华军  
【摘要】:目的:近年来的研究认为,细胞外基质(ECM)的代谢异常参与了糖尿病视网膜病变的病理过程。基质金属蛋白酶(MMP)及其组织抑制剂(TIMP)在细胞外基质代谢中起着重要作用,二者的调节平衡有利于维持视网膜的正常生理功能,与糖尿病视网膜病变的发生发展密切相关。本实验通过定性和半定量分析糖尿病小鼠视网膜组织中MMP-2、MMP-9及TIMP-2的表达情况,并同时观察糖尿病小鼠视网膜毛细血管及其基底膜的超微结构改变,旨在对基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用及其作用机制进行探讨,为临床预防、治疗糖尿病视网膜病变提供更为确切可靠的理论依据。 方法:选用从日本ャアツラ吉富会社引进C57BL/KsJ db/db糖尿病小鼠,无菌条件繁殖,清洁柜内饲养,保持环境安静,温度26±2℃,12小时光照/12小时黑暗循环,自由摄食、饮水。选用6周龄db/db小鼠24只,雌雄不限,其db/+型同性同窝瘦型鼠为对照,分别在2、6、9、12月龄时随机选择db/db小鼠及db/+小鼠各6只,20%巴比妥钠腹腔注射麻醉后,摘除左眼球,迅速取视盘侧距视盘约1mm处的1mm2 面积大小的视网膜组织固定于2.5%的戊二醛磷酸缓冲液中(PH7.6),制作透射电镜样品,用透射电镜观察视网膜毛细血管基底膜的形态学改变;同一眼球的其余视网膜 WP=4 组织后固定于4%多聚甲醛中,石蜡包埋,制成组织切片,行HE和免疫组织化学染色,用计算机-图象分析仪对糖尿病小鼠视网膜神经节细胞层和内核层中MMP-2、MMP-9和TIMP-2的表达情况进行平均灰度和面密度分析。(注:平均灰度值越低,说明免疫组化信号越强;面密度值越高阳性目标面积越大,相应的阳性细胞数越多。)同时光镜下观察MMP-2、MMP-9和TIMP-2在视网膜各层的表达情况,并对其进行免疫定位。实验数据用SAS软件处理,组间比较用方差分析,若有显著性差异,两组间比较用q检验。 结果:糖尿病小鼠与对照组小鼠相比,普通光镜下,糖尿病组小鼠与对照组小鼠相比视网膜各层细胞形态结构未见异常,而且在电镜下视网膜毛细血管及其基底膜的超微结构亦未见异常。但随病程进展,糖尿病小鼠视网膜毛细血管基底膜进行性增厚,内皮细胞胞质发出指状突起突向管腔。MMP-2、MMP-9及TIMP-2在正常对照组小鼠和糖尿病组小鼠视网膜的神经节细胞层和内核层的细胞及血管内皮细胞均有阳性表达。但随着病程进展,糖尿病小鼠视网膜神经节细胞层和内核层MMP-2和MMP-9表达的平均灰度值有显著性升高(p0.05),面密度值显著性降低(p0.05)。按2、6、9、12月组,MMP-2的平均灰度值依次为:105.6±0.9 ,120.7±2.6*,131.6±3.0*#,143.7±2.0*#△ ;MMP-2的面密度值依次为:0.09545±0.00714,0.07524±0.00602* ,0.05489±0.00613*#,0.03341±0.00353*#△。按2、6、9、12月组,MMP-9的平均灰度值依次为:192.7±2.3,174.2±2.5*,160.9±3.2*#,145.8±3.7*#△;MMP-9的面密度值依次为:0.12923±0.00522,0.10696±0.00676*,0.09193±0.00334*#,0.07598±0.00205*#△。 WP=5 随病程进展,TIMP-2表达的平均灰度值有显著性降低(p0.05),面密度值显著性升高(p0.05)。按2、6、9、12月组,TIMP-2的平均灰度值依次为:153.0±5.6 ,145.1±4.3*,136.7±4.1*#,120.5±3.8*#△;TIMP-2的面密度值依次为:0.05339±0.00419, 0.07354±0.00394*, 0.09790 ± 0.00943*# ,0.11047±0.01848*#△。同一病程阶段的MMP-2/TIMP-2的平均灰度值的比值随着病程进展明显升高(p0.05),而其面密度值的比值随着病程进展明显降低(p0.05)。按2、6、9、12月组,MMP-2/TIMP-2的平均灰度值比依次为:0.692±0.0259,0.832±0.0168*,0.963±0.0130*#,1.179±0.0405*#△;MMP-2/TIMP-2的面密度值比依次为:1.789±0.0493,1.020±0.0690*,0.561±0.0423*#,0.308±0.0530*#△。(注:*与2月组比较,p0.05;# 与6月组比较,p0.05;△与9月组比较,p 0.05;) 结论:随着病程进展,C57BL/KsJ db/db糖尿病小鼠视网膜毛细血管基底膜进行性增厚。基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9)及其组织抑制剂(TIMP-2)在血糖正常的C57BL/KsJ db/+和C57BL/KsJ db/db糖尿病小鼠的视网膜中均有阳性表达,免疫组织化学定位均在视网膜毛细血管集中分布的视网膜的内核层和神经节细胞层,提示它们极有可能参与了正常视网膜毛细血管基底膜和细胞外基质成分转换的过程,这非常有助于视网膜毛细血管基底膜结构和功能的稳定,从而有利于维持视网膜的正常生理功能。C57BL/KsJ db/db糖尿病小鼠在视网膜病变早期MMP-2的表达随病程进展显著下降,而能与MMP-2特异性结合TIMP-2的表达却随病程进展显著升高,而且MMP-2/TIMP-2的平均灰度比值随病程进展由小 WP=6 于1:1变化为大于1:1,其面密度比值由大于1:1变化为小于1:1,提示可能由于TIMP-2表达的增高,通过与MMP-2以1:1的比例结合成复合物的形式抑制了MMP-2的活性,另外又有MMP-9的表达随病程进展显著下降,结果使变性的基底膜胶原和细胞外基质成分的降解受阻,这可能是导致糖尿病视网膜病变早期视网膜毛细血管基底膜不断增厚的原因,从而会进一步加速糖尿病视网膜病变的发展。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R774.1

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