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《河北医科大学》 2005年
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野生型p53基因治疗涎腺腺样囊性癌的实验研究

闫炳智  
【摘要】:目的:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是较为常见的涎腺恶性肿瘤之一。由于其侵袭性广,尤其是嗜神经并沿其逐渐扩散,易血行转移,术后易于复发。该肿瘤对放疗、化疗不敏感,所以远期疗效不佳。为了探讨p53基因在临床治疗涎腺腺样囊性癌的可行性,本实验以涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83为对象观察了腺病毒载体介导的外源性野生型p53基因对其端粒酶活性及转录调节的影响以及对SACC-83细胞生物学特性的作用;检测SACC-83细胞中DNA polβ启动子的活性;并对不同启动子调控的p53基因表达的变化和p53基因在引起DNA损伤的各种刺激因素下的反应做初步的探讨,旨在为开展体内涎腺腺样囊性癌的p53基因治疗提供新的途径及理论依据。 方法:将外源性野生型p53基因片段(1.8 kb)重组于腺病毒表达载体pΔE1构建真核表达载体pΔE1-p53;以Tfx~(TM)-20脂质体法瞬时转染涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83,并以转染空载体p?E1及未转染细胞为对照。RT-PCR检测外源性野生型p53基因mRNA的表达,TRAP-PCR-ELISA法(端粒重复序列扩增法-酶联免疫试验)定量分析转染涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83端粒酶活性的变化情况;构建含有端粒酶逆转录催化亚单位hTERT启动子核心调控区-586bp~+35bp片段(630bp)的荧光素酶报告重组体pGL2-630,将pΔE1-p53、pGL2-630瞬时共转染SACC-83细胞,转染中以β-半乳糖苷酶表达质粒做共转染,以便校正转染效率,48h后收获细胞,液体闪烁计数仪检测荧光素酶报告基因活性,酶标仪分析β-gal活性,计算荧光素酶活性与β-gal活性的比值,得到相对荧光素酶活性,分析外源性p53基因表达对hTERT转录调节的直接作用。脂质体法将外源性野生型p53基因稳定转染涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83,以稳定转染空载体pΔE1的SACC-83细胞及未转染的SACC-83细胞为对照。400μg.ml~(-1) G418筛选4周,挑选稳定单个克隆并逐步扩大培养;同样RT-PCR检测外源性野生型p53基因的表达以及p53基因对端粒酶逆转录催化亚单位hTERT mRNA表达的影响;流式细胞术分析
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R739.8

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【参考文献】
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