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《河北医科大学》 2007年
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不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞增殖及周期调控分子表达的影响

王智华  
【摘要】: 目的肿瘤是严重威胁人类生命健康的重大疾病;转染抗瘤相关细胞因子基因,是探索肿瘤基因治疗的重要领域。白细胞介素15(IL-15)是1994年发现的与IL-2有类似生物活性的细胞因子,可促进NK细胞和CTL细胞增殖并提高它们杀瘤活性。人体许多组织细胞都有IL-15mRNA表达但少有IL-15蛋白分泌,提示IL-15体内正常作用有可能主要是在细胞内发挥。已有报道将原型IL-15基因转染的肿瘤细胞植入裸鼠体内,并未获得理想的高效抗瘤效果,推测可能与原型IL-15基因自身长信号肽抑制其蛋白分泌有关。但转染能促进蛋白分泌的改型IL-15基因,也未取得预期效果。 我们先前发现不同IL-15基因转染人小细胞肺癌细胞株NCI-H446肿瘤细胞,可明显降低其细胞的增殖速率,只是降低的程度彼此不尽一致。肿瘤细胞是由正常细胞突变而来,与其来源的正常组织细胞相比,细胞周期失控增殖速率加快是其主要恶性特征之一。迄今发现,细胞内影响细胞增殖速率的相关分子主要有:细胞周期正调控分子细胞周期蛋白(cyclin)和周期蛋白依赖性激酶(CDK)及细胞周期负调控分子CDK抑制蛋白(CDKI)和某些抑癌基因编码蛋白。 本研究用本室已成功构建的3种转染不同形式IL-15基因的NCI-H446细胞模型(转染原型IL-15基因的CIL-15、转染IL-15成熟肽基因的CIL-15mp和转染以IL-2信号肽替代IL-15信号肽的改型IL-15基因的CIL-2sp-IL-15mp)作实验组,用野生型NCI-H446细胞(Cw)作对照组,研究不同形式IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞增殖的影响,以及对细胞周期正调控分子(cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4)和细胞周期负调控分子(p21和Rb)的蛋白及mRNA表达的影响,揭示其分子基础,为进一步探索IL-15基因的抗肿瘤作用提供有益的线索和启示。 方法 1以野生株NCI-H446细胞(CW)为对照组,用本室已构建的3种分别以不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞模型(原型IL-15基因转染的CIL-15、IL-15成熟肽基因转染的C_(IL-15mp)和以IL-2信号肽替代IL-15信号肽的改型IL-15基因转染的CIL-2sp-_(IL-15mp))为实验组,台盼蓝拒染法在连续8天的培养中每天计数活细胞,并绘制细胞生长曲线;MTT法检测培养24h、48h、72h和96h四个时间点的细胞增殖;流式细胞术分析细胞周期的变化。 2以野生株NCI-H446细胞(C~W)为对照,检测3种转染不同IL-15基因的NCI-H446细胞模型细胞(CIL-15、C_(IL-15mp)和CIL-2sp-_(IL-15mp))中,细胞周期正调控分子cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4的蛋白表达(Western-blot法)和mRNA表达(RT-PCR法)。 3以野生株NCI-H446细胞(C~W)为对照,检测3种转染不同IL-15基因的NCI-H446细胞模型细胞(CIL-15、C_(IL-15mp)和CIL-2sp-_(IL-15mp))中,细胞周期负调控分子p21和Rb的蛋白表达(Western-blot法)和mRNA表达(RT-PCR法)。 结果1不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞增殖的影响 1.1细胞增殖台盼蓝拒染法的活细胞计数 在培养后的第五天细胞计数分别为[(71.18±5.16)×104(C~w)]、[(58.93±3.34)×104 (CIL-15)]、[(35.82±2.45)×104 (C_(IL-15mp))]和[(25.4±2.84)×104 (CIL-2sp-_(IL-15mp))]。自培养后的第5天始至第8天,转染3种不同IL-15基因的NCI-H446细胞生长速率均较野生株细胞增殖减慢且减慢的程度不同(P0.05或P0.01);四种细胞的增殖速率由快至慢依次为C~w、CIL-15、C_(IL-15mp)、CIL-2sp-_(IL-15mp)。 1.2细胞增殖的MTT测定 72h培养时间点的OD值分别为1.124±0.091(C~w)、0.968±0.084 (CIL-15)、0.786±0.084 (C_(IL-15mp))和0.627±0.156(CIL-2sp-_(IL-15mp));96h培养时间点的OD值分别为1.564±0.163 (C~w)、1.262±0.135(CIL-15)、0.928±0.070 (C_(IL-15mp))和0.777±0.030 (C IL-2sp-_(IL-15mp))。在两个时间点中,3种转染不同IL-15基因的NCI-H446细胞的OD值均较野生株细胞低,但程度不同(P0.05或P0.01);四种细胞的OD值由高到低,依次为C~w、CIL-15、C_(IL-15mp)、CIL-2sp-_(IL-15mp)。 2不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞周期的影响 四种细胞G0/G1期的比例分别是([69.44±3.26)%(C~w)], ([73.47±1.49)% (C_(IL-15))], ([76.81±1.41)%(C_(IL-15mp))]和([81.26±2.31)%(C_(IL-2sp-IL-15mp))],彼此间都有显著性差异(P0.05或P0.01); 3种转染IL-15基因的NCI-H446细胞G0/G1期的比例都显著高于野生株NCI-H446 G0/G1期的比例(P0.05或P0.01)。四种细胞G0/G1期细胞比例由高到低,依次为C_(IL-2sp-IL-15mp)、C_(IL-15mp)、C_(IL-15)、C~w。 四种细胞S期的比例分别是[(26.90±1.43)%(C~w)]、[(19.94±1.72)%(C_(IL-15))]、[(16.11±1.80)%(C_(IL-15mp))]和[(12.80±0.59)%(C_(IL-2sp-IL-15mp))],彼此间都有显著性差异(P0.05或P0.01); 3种转染IL-15基因的NCI-H446细胞S期的比例都显著低于野生株NCI-H446细胞S期的比例(均P0.01)。四种细胞S期比例由低到高依次为C_(IL-2sp-IL-15mp)、C_(IL-15mp)、C_(IL-15)、C~w。 3不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞周期正调控分子表达的影响 3.1 cyclin D1的表达 cyclin D1蛋白的表达分别是0.893±0.182 (C~w)、0.717±0.148 (C_(IL-15))、0.749±0.172 (C_(IL-15mp))和0.786±0.172 (C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比,3种不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞cyclin D1蛋白表达均与之无显著性差异(均P0.05);3种不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞间的表达也均无显著性差异(均P0.05)。表明3种不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞cyclin D1的蛋白表达无影响。 Cyclin D1mRNA的表达分别是0.52±0.046 (C~w)、0.47±0.125 (C_(IL-15))、0.52±0.049 (C_(IL-15mp))和0.54±0.057 (C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比,3种不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞cyclin D1mRNA表达均与之无显著性差异(均P0.05);3种不同IL-15基因转染的NCI-H446细胞间的表达也均无显著性差异(均P0.05)。表明3种不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞cyclin D1mRNA的表达无影响。 3.2 cyclin E的表达 cyclin E蛋白的表达分别为1.154±0.153 (C~w)、0.911±0.196(C_(IL-15))、0.720±0.112 (C_(IL-15mp))和0.531±0.104 (C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比, 3种不同IL-15基因转染细胞模型(C_(IL-15)、C_(IL-15mp)、C_(IL-2sp-IL-15mp) )cyclin E蛋白的表达均降低(P0.05, P0.05,P0.01);且C_(IL-15)、C_(IL-15mp)和C_(IL-2sp-IL-15mp)间,均有显著性差异(均P0.05)。表明转染3种不同IL-15基因,均可以降低NCI-H446肿瘤细胞cyclin E蛋白的表达,但降低的程度不同。四种细胞cyclin E蛋白的表达量,由高到低依次为C~w、C_(IL-15)、C_(IL-15mp)、C_(IL-2sp-IL-15mp)。转染3种不同IL-15基因的NCI-H446细胞cyclin E蛋白表达的降低与G0/G1期细胞比例升高呈负相关(r=-0.983,P0.01),与S期细胞比例降低呈正相关( r=0.993,P0.01)。 Cyclin E mRNA的表达分别是1.10±0.121 (C~w)、0.93±0.073 (C_(IL-15))、0.76±0.059 (C_(IL-15mp))和0.48±0.056 (C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比,3种不同IL-15基因转染细胞模型(C_(IL-15)、C_(IL-15mp)、C_(IL-2sp-IL-15mp) )cyclin E mRNA的表达均降低(P0.05, P0.05,P0.01);且C_(IL-15)、C_(IL-15mp)和C_(IL-2sp-IL-15mp)间,均有显著性差异(均P0.05)。表明转染3种不同IL-15基因,均可以降低NCI-H446肿瘤细胞cyclin E mRNA的表达,但降低的程度不同。四种细胞cyclin E mRNA的表达量,由高到低依次为C~w、C_(IL-15)、C_(IL-15mp)、C_(IL-2sp-IL-15mp)。转染3种不同IL-15基因的NCI-H446细胞cyclin E mRNA表达的降低与G0/G1期细胞比例升高呈负相关( r=-0.998,P0.01),与S期细胞比例降低呈正相关( r=0.957,P0.05)。 3.3 CDK2的表达 CDK2蛋白的表达分别是0.689±0.251 (C~w)、0.257±0.106 (C_(IL-15))、0.254±0.120 (C_(IL-15mp))和0.385±0.046 (C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比,3种不同IL-15基因转染细胞模型(C_(IL-15)、C_(IL-15mp)、C_(IL-2sp-IL-15mp) )CDK2蛋白的表达均降低(P0.01,P0.01, P0.05);但C_(IL-15)、C_(IL-15mp)和C_(IL-2sp-IL-15mp)间,无显著性差异(P0.05)。表明转染3种不同IL-15基因,可同等程度地降低NCI-H446肿瘤细胞CDK2蛋白的表达。 CDK2 mRNA的表达分别是0.964±0.139 (C~w)、0.560±0.167 (C_(IL-15))、0.683±0.049 (C_(IL-15mp))和0.622±0.023 (C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比, C_(IL-15)、C_(IL-15mp)、C_(IL-2sp-IL-15mp)的CDK2 mRNA表达均显著降低(P0.01,P0.05,P0.01)。在C_(IL-15)、C_(IL-15mp)和C_(IL-2sp-IL-15mp)间,CDK2 mRNA的表达彼此无显著性差异(P0.05)。表明转染3种不同IL-15基因,均可以同程度地降低NCI-H446肿瘤细胞CDK2mRNA的表达。 3.4 CDK4的表达 CDK4蛋白的表达分别是1.694±0.506(C~w)、1.067±0.338(C_(IL-15))、1.038±0.311(C_(IL-15mp))和0.974±0.255(C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比,C_(IL-2sp-IL-15mp)的CDK4蛋白表达降低(P0.05),而C_(IL-15)和C_(IL-15mp)较之无显著性差异(均p0.05)。C_(IL-15)、C_(IL-15mp)和C_(IL-2sp-IL-15mp)间的CDK4蛋白表达无显著性差异(P0.05)。表明改型IL-15基因的转染可轻度降低NCI-H446肿瘤细胞CDK4蛋白的表达,而原型或成熟肽基因的转染对NCI-H446肿瘤细胞CDK4蛋白的表达均无显著影响。 CDK4 mRNA的表达分别是0.630±0.045( C~w)、0.651±0.082( C_(IL-15))、0.561±0.061 (C_(IL-15mp))和0.666±0.027 (C_(IL-2sp-IL-15mp))。四种细胞间CDK4 mRNA表达无显著性差异(P0.05),表明3种不同IL-15基因转染都不能显著影响NCI-H446肿瘤细胞CDK4 mRNA的表达。 4不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞周期负调控分子表达的影响 4.1 p21的表达 p21蛋白的表达分别是0.907±0.042 (C~w)、1.052±0.086 (C_(IL-15))、0.848±0.084 (C_(IL-15mp))和0.878±0.050 (C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比,C_(IL-15)的p21蛋白表达量增加(P0.05),C_(IL-15mp)和C_(IL-2sp-IL-15mp)与之无显著性差异(均P0.05)。表明原型IL-15基因转染可增加NCI-H446肿瘤细胞的p21蛋白表达;成熟肽基因或改型基因的转染,对NCI-H446肿瘤细胞的p21蛋白表达无显著影响。 p21 mRNA的表达分别是0.455±0.051 (C~w)、0.747±0.061 (C_(IL-15))、0.516±0.093 (C_(IL-15mp))和0.512±0.117(C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比,C_(IL-15)的p21 mRNA表达量增加(P0.01),C_(IL-15mp)和C_(IL-2sp-IL-15mp)与之无显著性差异(均P0.05)。表明原型IL-15基因转染可增加NCI-H446肿瘤细胞的p21 mRNA表达;成熟肽基因或改型基因的转染,对NCI-H446肿瘤细胞的p21 mRNA表达无显著影响。 4.2 Rb的表达 Rb蛋白的表达分别是0.860±0.184 (C~w)、1.132±0.150 (C_(IL-15))、0.959±0.221 (C_(IL-15mp))和0.938±0.091(C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比,C_(IL-15)的Rb蛋白表达量增加(P0.05),C_(IL-15mp)和C_(IL-2sp-IL-15mp)与之无显著性差异(均P0.05)。表明原型IL-15基因转染可增加NCI-H446肿瘤细胞的Rb蛋白的表达,而成熟肽基因转染或改型基因转染对NCI-H446肿瘤细胞的Rb蛋白表达无显著影响。 Rb mRNA的表达分别是0.787±0.075 (C~w)、1.176±0.080 (C_(IL-15))、0.899±0.103 (C_(IL-15mp))和0.775±0.087 (C_(IL-2sp-IL-15mp))。与C~w相比,C_(IL-15)和C_(IL-15mp)的Rb mRNA表达量显著增加(均P0.01), C_(IL-2sp-IL-15mp)与之相比无显著性差异(P0.05)。表明原型IL-15基因或成熟肽基因转染可增加NCI-H446细胞Rb mRNA的表达,而改型IL-15基因转染不影响NCI-H446细胞Rb mRNA的表达。 结论 1 3种不同IL-15基因转染可减慢NCI-H446肿瘤细胞增殖速率,减慢程度由高至低依次为C_(IL-2sp-IL-15mp)、C_(IL-15mp)、C_(IL-15);减慢NCI-H446肿瘤细胞增殖速率与升高G0/G1期比例和降低S期比例有关。 2 3种不同IL-15基因转染致NCI-H446肿瘤细胞增殖速率减慢和G0/G1期比例升高及S期比例降低,可能主要是由降低细胞周期正调控分子cyclin E的表达引起。 3 3种不同IL-15基因转染致NCI-H446肿瘤细胞增殖速率减慢和G0/G1期比例升高及S期比例降低,主要不是由影响细胞周期负调控分子p21和Rb的表达引起。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R73-3

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3 陈根云;陈桂强;;角膜内皮细胞的再生特性及影响因素[J];中国组织工程研究与临床康复;2008年31期
4 付鹏;牛铁生;孙英贤;;富含半胱氨酸蛋白61 RNA干扰质粒抑制血管平滑肌细胞的增殖[J];中华高血压杂志;2008年04期
5 范仲凯;张元和;姚琦;卢伟;;转染血管内皮生长因子基因的人成骨细胞增殖及其生物学功能[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年50期
6 赵丽敏;徐永健;熊盛道;张珍祥;;转染Kv1.5基因抑制人气道平滑肌细胞的增殖[J];中国病理生理杂志;2007年01期
7 左玲;栾永昕;裴颖;赵惠敏;苏冠方;;KDRn3蛋白在人脐静脉血管内皮细胞中的表达及对其增殖的抑制作用[J];中国生物制品学杂志;2008年09期
8 林芬;李建英;陈丰霖;陈治新;王小众;;15-LOX-1基因表达对胃癌细胞增殖的抑制作用[J];胃肠病学和肝病学杂志;2008年09期
9 张学彦;姜仪增;刘志强;景德怀;关景明;刘伟;;p21~(WAF1)基因对人胰腺癌细胞系BxPC-3增殖的抑制作用[J];世界华人消化杂志;2009年16期
10 胡运生;范清宇;马保安;裘秀春;潘勇;;hBMP-2基因转染兔骨髓间充质干细胞的表达及生物学效应的观察[J];中国美容医学;2006年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 丁军颖;王润田;王智华;崔澂;韩志鹏;李铁民;张征峥;邓郁青;;不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞诱导PBMC杀瘤能力的影响[A];河北省免疫学会第5次会员代表暨学术大会论文摘要集[C];2006年
2 丁军颖;王润田;王智华;崔澈;韩志鹏;李铁民;张征峥;邓郁青;;不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞诱导PBMC杀瘤能力的影响[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
3 吴卉娟;翁丹卉;邢辉;宋晓红;卢运萍;王世宣;马丁;;PTEN基因转染对人卵巢癌A2780细胞增殖和侵袭活性的影响[A];中华医学会第一届全球华人妇产科学术大会暨第三次全国妇产科中青年医师学术会议论文汇编[C];2007年
4 王智华;王润田;丁军颖;张征峥;邓郁青;王平;;不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞增殖的影响[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年
5 王智华;王润田;丁军颖;张征峥;邓郁青;王平;;不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞增殖的影响[A];河北省免疫学会第5次会员代表暨学术大会论文摘要集[C];2006年
6 王季石;胡秀英;方琴;谢建琼;崔欣;;ALDH2基因转染对白血病细胞增殖与凋亡的影响[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
7 郭亮;韩雅玲;闫承慧;郭鹏;邓捷;麦晓燕;;腺病毒介导E1A激活基因阻遏子基因转染抑制兔颈动脉球囊拉伤后新生内膜形成[A];中华医学会第11次心血管病学术会议论文摘要集[C];2009年
8 郭亮;韩雅玲;闫承慧;郭鹏;邓捷;麦晓燕;李少华;;腺病毒介导CREG基因转染抑制兔颈动脉球囊拉伤后新生内膜形成[A];中华医学会心血管病学分会第十次全国心血管病学术会议汇编[C];2008年
9 谢倩;刘康达;胡美玉;吴祥甫;周康;;SF/HGF cDNA转染对肝癌SMMC7721细胞恶性行为的影响[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年
10 金吴东;陈龙华;;mⅠκBα基因转染肝癌细胞的放射增敏机制研究[A];中华医学会放射肿瘤治疗学分会六届二次暨中国抗癌协会肿瘤放疗专业委员会二届二次学术会议论文集[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者 刘亚东;有了生物芯片 大海捞针不难[N];科技日报;2001年
2 ;日本科学家发现抑制癌细胞增殖的基因[N];中国高新技术产业导报;2001年
3 张可喜;日发现抑制癌细胞增殖的基因[N];中国中医药报;2001年
4 刘耀辉;CD4和CD8细胞增殖与HIV荷载量无关[N];中国医药报;2005年
5 张平;丹酚酸B可抑制原代肝星状细胞增殖[N];中国医药报;2006年
6 罗明凤 黄秀深 赵娟;理中丸通过“细胞增殖”调节胃肠运动功能[N];中国中医药报;2009年
7 李凯;化疗也艺术[N];健康报;2006年
8 芦勤;我国科学家发现细胞增殖抑制基因[N];中国医药报;2004年
9 顾正勤 孙颖浩 许传亮;揭示黄芩苷诱导前列腺癌细胞凋亡机制[N];中国医药报;2005年
10 陈香美 谢院生;以细胞生物学指导肾病防治[N];健康报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王智华;不同IL-15基因转染对NCI-H446肿瘤细胞增殖及周期调控分子表达的影响[D];河北医科大学;2007年
2 丁军颖;不同IL-15基因转染对NCI-H446细胞免疫生物学特性的影响[D];河北医科大学;2006年
3 曹毅;用基因打靶技术构建恶性疟原虫MSP1转基因鼠疟模型及其应用[D];第二军医大学;2005年
4 梁日生;转TrkC基因神经干细胞移植治疗脊髓损伤的实验研究[D];复旦大学;2005年
5 张瑞芬;金属硫蛋白与乳腺癌关系的研究[D];中国协和医科大学;1999年
6 周艳;乳腺癌ERβ表达的临床意义及其与他莫昔芬治疗耐药相关意义的初步研究[D];第三军医大学;2007年
7 欧雅莉;GDNF基因修饰脐血细胞并血脑屏障开放剂对高血压脑梗疗效的实验研究[D];中南大学;2009年
8 李晓强;转染VEGF165基因的内皮祖细胞移植治疗慢性深静脉血栓的实验研究[D];苏州大学;2008年
9 李小明;mTOR基因转染对NIH3T3成纤维细胞增殖的影响及其作用机制研究[D];中南大学;2008年
10 熊文化;PIN1反义基因对人骨肉瘤的抑制作用[D];华中科技大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高超;人CD83转基因细胞的构建及鼠抗人CD83单克隆抗体的研制[D];苏州大学;2009年
2 刘彤;鼠抗人ICOS单克隆抗体的研制及GL50-ICOS信号对T细胞共刺激作用的研究[D];苏州大学;2006年
3 许杰;TGF-β1转基因牙龈成纤维细胞生物学特性及其胞内信号转导的初步研究[D];第四军医大学;2005年
4 赵静;脂质体介导转染的绿色荧光蛋白基因在骨髓基质细胞内表达[D];山东大学;2005年
5 骆书美;超声微泡介导pEGFP-N1转染人牙龈成纤维细胞的初步研究[D];重庆医科大学;2009年
6 姚珂;反义PNA抑制端粒酶活性对肺癌A549细胞影响的研究[D];第三军医大学;2004年
7 梁政;rAAV/AFP转染对人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能研究[D];第一军医大学;2005年
8 林桂渺;TIMP-3真核表达载体构建以及在前列腺癌细胞株中作用的研究[D];吉林大学;2006年
9 种瑞峰;p21~(waf1)基因转染对乳腺癌细胞增殖活性和中心体复制的影响[D];青岛大学;2008年
10 林霞;纳米基因载体酶切保护机理的研究及新型基因载体的制备与应用[D];湖南大学;2005年
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