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过度训练致急性肾损伤的分子机制及解痉抗炎抗氧化中药的防治作用

吴广礼  
【摘要】: 目的:过度训练是由于运动训练负荷过大,超过机体的承受能力,导致多器官功能紊乱的病理状态。近年来,过度训练引起脏器损伤的研究受到重视,但过度训练引起急性肾损伤(overtraining-induced acute kidney injury, OTIAKI)的研究工作不多,进展不大,有关OTIAKI的特征及其发病机制还不清楚。近年研究发现,肾组织细胞凋亡参与了运动性蛋白尿的发生,但肾组织细胞凋亡在OTIAKI中的作用及其发生的分子机制尚未阐明,对OTIAKI的防治在临床上尚缺乏有效的药物。中药唐古特莨菪提取物山莨菪碱具有解除血管痉挛、改善微循环的作用,对缺血性急性肾衰竭具有防治作用;从欧亚旋覆花提取的有效成分旋覆花素可通过抗炎信号转导途径影响细胞的凋亡;苦碟子的有效成分可通过清除自由基和抗氧化作用防治缺血再灌注损伤。这三种药物对各种原因引起的组织缺血、缺氧和细胞凋亡具有拮抗作用,但它们是否能防治OTIAKI及其防治OTIAKI的分子机制尚未见文献报道。本研究通过让大鼠游泳至力竭,建立大鼠过度训练致急性肾损伤模型,采用多种实验技术,分别检测各组大鼠肾功能及肾组织结构的改变以及肾组织细胞凋亡及凋亡相关基因表达的变化;从多层次研究了OTIAKI时肾损伤的病理特征及其发病机制,阐明肾损伤过程中肾细胞凋亡的诱发因素、基因调控及细胞内信号转导途径,观察山莨菪碱、旋覆花素和苦碟子对OTIAKI的防治作用及其分子机制,加深对OTIAKI发病机制的认识,寻求新的治疗靶位点,为临床OTIAKI的防治提供新的理论依据和措施。 方法:将80只雄性Wistar大鼠(体重200~220g)随机分为安静对照组(control,CN,n=8)、力竭运动组(exhaustive swimming,ES,n=24)、山莨菪碱干预组(Anisodamine, AD,n=16)、旋覆花素干预组(Inula Britannica,IB,n=16)、苦碟子干预组(Ixeris Sonchifolia,IS,n=16)。CN组为安静对照;ES组又根据力竭后恢复时间分为力竭后即刻(ESI)、力竭后6h(ES 6h)和力竭后24h (ES 24h);AD组于力竭运动前20 min腹腔注射山莨菪碱10 mg/kg后进行力竭运动,分为AD 6h和AD 24h组;IB组于力竭运动前24h分三次口腔灌入旋覆花素25 ml/kg(含ABL65 mg/kg)后进行力竭运动,分为IB 6h和IB 24h组;IS组于力竭运动前20 min腹腔注射苦碟子注射液20 g/kg(含总黄酮8 mg/kg和腺苷0.05 mg/kg)后进行力竭运动,分为IS 6h和IS 24h组。每个时间点8只大鼠。采用大鼠游泳至力竭建立过度训练致急性肾损伤模型;用日立7170A全自动生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐(Cr)、尿素(Ur)、磷酸肌酸激酶(CK)及尿γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-GT);光镜及电镜观察各组大鼠肾组织结构的改变; TUNEL法及流式细胞术检测各组大鼠肾组织细胞凋亡;免疫组化法及流式细胞术检测各组大鼠肾组织NF-КB、Fas-L、Caspase-8、Caspase-9的变化;免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织TNF-α、Bax、Bcl-2、Bid及E-Cadherin蛋白的表达;黄嘌呤氧化酶法测定血清和肾组织中SOD的活力,用硫代巴比妥酸法测定血清和肾组织中MDA的含量。实验数据用均数±标准差(ˉx±s)表示,用SPSS 12.0软件包进行统计学分析,组间差异用单因素方差分析,以P0.05为有统计学意义。 结果: 1过度训练致大鼠急性肾损伤的结构特征及炎症细胞因子和NF-КB的作用 为了了解过度训练致OTIAKI的损伤特征,本部分实验观察了过度训练大鼠肾脏功能、形态及代谢的变化。结果表明,力竭后即刻大鼠血清Ur、Cr、CK即明显升高,6h达高峰,24h恢复到对照水平;于力竭后6h尿γ-GT也明显升高,力竭后24h尿γ-GT升高更为明显。光镜观察发现,力竭后即刻和力竭后6h大鼠肾组织结构变化轻微,力竭后24h可见肾小管上皮细胞刷状缘不规整,部分脱落,在皮髓质交界处及髓质可见大量细胞的细胞核深染,有固缩现象。电镜观察发现,力竭即刻大鼠肾小球滤过膜足突融合,近曲小管微绒毛排列稍紊乱,上皮细胞质明显水肿,线粒体大部或全部嵴和膜融合或消失,核染色质浓缩,电子密度增高并边集于核膜下,提示有早期细胞凋亡现象;力竭后6h及24h上述变化加重。TUNEL法及流式细胞术检测显示,力竭后即刻、6h、24h肾组织细胞凋亡率呈进行性增高,各时间点均明显高于CN组(P0.05);各组尿γ-GT与肾细胞凋亡率呈明显的正相关(γ=0.98,P0.01)。上述结果说明过度训练可引起肾脏功能和形态方面的损伤;肾功能损伤既有肾小球滤过功能障碍,也有肾小管功能的障碍;肾组织结构的损伤以细胞凋亡占细胞损伤方式的主体。由此提示,肾组织细胞凋亡既是OTIAKI的主要损伤特征和细胞学基础,也是OTIAKI的关键发病机制。 为进一步了解氧化应激在OTIAKI发病中的作用,本部分实验又观察了过度训练大鼠血清和肾组织SOD及MDA的变化。结果表明,力竭后即刻和力竭后6h大鼠血清和肾组织SOD明显降低(P0.05),MDA明显升高(P0.05);血清SOD和MDA两种指标于力竭后24h恢复达到对照组水平,肾组织SOD和MDA与力竭后6h比较均有所恢复,但未达到对照组水平。这些结果说明氧化应激在OTIAKI的发病中发挥重要作用;提示氧化应激反应可能主要参与力竭后早期引起的肾损伤过程,而延迟性肾实质细胞损伤可能还有其它因素参与。因此,本研究又观察了过度训练大鼠肾组织TNF-α和NF-КB的变化。结果显示,力竭后即刻、6h、24h大鼠肾组织TNF-α表达进行性升高(P0.05),各时间点均明显高于CN组(P0.05);免疫组化和流式细胞术检测显示,力竭后即刻、6 h、24 h肾组织NF-КB进行性增高,各时间点均明显高于CN组(P0.05)。说明TNF-α和NF-КB在OTIAKI的发病中发挥重要作用,提示过度训练可通过炎症信号通路介导肾细胞的凋亡,最终导致急性肾损伤。上述结果为寻求OTIAKI防治的靶位点提供了有意义的信息。 2山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练大鼠急性肾损伤的防治作用 山莨菪碱、旋覆花素和苦碟子是公认的解痉抗炎抗氧化中药,它们对各种原因引起的组织缺血、缺氧和细胞凋亡具有拮抗作用,为寻求OTIAKI的防治药物,本研究观察了上述三种药物对OTIAKI的肾脏保护作用。结果表明,AD、IB及IS组大鼠游泳至力竭的时间比ES明显延长(P0.05,P0.01);AD、IB及IS组大鼠于力竭后6h血Ur、Cr、CK及尿γ-GT均明显低于ES组(P0.05);于力竭后24h,尿γ-GT也较ES组明显降低(P0.01);AD、IB及IS 6h及24h组大鼠肾组织结构和超微结构变化减轻; TUNEL法及流式细胞术检测显示,AD、IB及IS组大鼠于力竭后6h及24h肾细胞凋亡率均明显低于同期ES组(P0.05),但仍明显高于CN组, AD组大鼠于力竭后24h肾细胞凋亡率明显低于同期IB及IS组(P0.05)。这些结果说明,山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子均在减轻过度训练大鼠肾组织形态学损伤和改善肾功能的同时,明显提高了大鼠的运动能力。 为进一步研究山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子防治OTIAKI的机制,本实验又观察了上述三种药物对过度训练大鼠血清和肾组织SOD及MDA以及肾组织TNF-α和NF-КB变化的影响。结果表明,于力竭后6h,山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子三种药物对过度训练引起的大鼠血清和肾组织SOD活性的降低和MDA含量的增高均具有不同程度的逆转作用;于力竭后24h,三种药物组大鼠血清和肾组织SOD和MDA均恢复到对照组水平。免疫组化显示,山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子组大鼠于力竭后6h及24h肾组织TNF-α水平明显降低(P0.05),但仍明显高于对照组(P0.05)。免疫组化及流式细胞术检测显示,于力竭后6h,三种药物组大鼠肾组织NF-КB表达显著低于同期力竭组(P0.05),但仍明显高于对照组(P0.05);于力竭后24h,三种药物组大鼠肾组织NF-КB表达也显著低于同期力竭组(P0.05),山莨菪碱和旋覆花素组降低更加明显(P0.05),但仍明显高于对照组(P0.05)。上述结果说明,山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子可通过抗氧化应激反应、抑制炎症信号通路,减少肾组织细胞凋亡,进而减轻了过度训练引起的急性肾损伤,山莨菪碱和旋覆花素的效果优于苦碟子。 3过度训练大鼠肾组织细胞凋亡的基因调控及山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子的影响 为了探讨过度训练所致的肾组织细胞凋亡的机制,本研究进一步观察了大鼠力竭及药物干预下肾组织细胞凋亡相关基因表达的变化。结果显示,力竭后即刻、6h和24h大鼠肾组织Bax的表达水平进行性升高(P0.05),Bcl-2的表达水平则表现相反的进行性减弱(P0.05),Bax/Bcl-2比值增高(P0.05)。各组大鼠肾组织Bax/Bcl-2比值与肾细胞凋亡率呈明显的正相关(r=0.674,P0.01)。说明过度训练大鼠肾组织Bax与Bcl-2的表达及其比值的变化是肾组织细胞凋亡发生的重要的基因调控机制。应用山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子6h组大鼠与同期力竭组比较,肾组织Bax的表达减弱(P0.05),AD及IB组比IS组更明显(P0.05);Bcl-2的表达增高(P0.05);Bax/Bcl-2比值降低(P0.05),AD及IB组降低更为明显(P0.05)。应用山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子24h组大鼠与同期力竭组比较,肾组织Bax的表达减弱(P0.05), Bcl-2的表达增高(P0.05),AD组更为明显(P0.05);Bax/Bcl-2比值明显降低(P0.05)。结果表明,三种药物可通过调整凋亡相关基因表达的平衡而阻止过度训练诱导的肾组织细胞凋亡,其作用效果山莨菪碱和旋覆花素优于苦碟子。 4 Caspase凋亡相关信号通路在过度训练致大鼠肾组织细胞凋亡中的作用 为了探讨过度训练引起肾组织细胞凋亡的细胞信号通路,并寻求调控细胞凋亡关键通路的新药作用靶点,本研究用免疫组化和流式细胞术检测了一组Caspase凋亡相关信号分子在力竭后不同时间的表达活性变化。结果显示,力竭后即刻、6h、24h大鼠肾组织Fas-L、Caspase-8、Caspase-9及Bid蛋白的表达活性进行性增高(P0.05),各时间点均明显高于对照组(P0.05)。这些结果说明,Fas-L、Caspase-8、Caspase-9及Bid参与介导过度训练所致的肾组织细胞凋亡,同时也提示Caspase凋亡相关信号通路在过度训练致大鼠肾组织细胞凋亡中发挥重要作用,为寻求OTIAKI的防治提供了新的分子靶点。 5山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子多靶点防治过度训练大鼠肾组织细胞凋亡的分子机制 为了阐明山莨菪碱、旋覆花素和苦碟子防治过度训练诱导肾组织细胞凋亡的分子机制,本研究又观察了上述三种药物对过度训练所致肾组织细胞凋亡相关细胞信号通路中关键分子表达的影响。采用免疫组化和流式细胞技术检测结果表明,给予三种药物的大鼠在力竭后6h和24h与同期单纯力竭组比较,肾组织FasL、Caspase-8、Caspase-9及Bid蛋白的表达均显著降低(P0.05),但尚未恢复到对照组水平。在作用效果上,山莨菪碱、旋覆花素比苦碟子更明显。结果提示三种药物可不同程度消弱Caspase凋亡相关信号通路中凋亡信号的转导。 免疫组化检测还显示,力竭后即刻、6h及24h大鼠肾组织E-cadherin表达进行性减弱(P0.05),各时间点均明显低于对照组(P0.05)。山莨菪碱、旋覆花素及苦碟子组大鼠于力竭后6h及24h肾组织E-cadherin表达明显高于同期单纯力竭组(P0.05),达对照组水平。结果提示,过度训练后肾组织E-cadherin的丢失在OTIAKI中发挥重要作用,三种药物均能抑制过度训练引起的肾组织E-cadherin的降解和丢失,进而减轻了肾组织细胞的凋亡和肾小管上皮细胞的损伤。 结论: 1过度训练大鼠出现肾功能及肾组织形态学损伤,这种损伤以细胞凋亡占细胞损伤的主体,提示肾组织细胞凋亡既是OTIAKI的损伤特征,也是OTIAKI的关键发病机制,及时采取药物干预是OTIAKI防治的关键。 2过度训练可通过增强氧化应激反应,破坏肾组织Bax/Bcl-2的平衡,上调炎症信号通路及Caspase凋亡相关信号通路中关键信号蛋白的表达,强化凋亡信号转导进而诱导肾组织细胞凋亡,还可使肾组织E-cadherin降解和丢失,导致急性肾损伤。 3山莨菪碱、旋覆花素和苦碟子可通过抗氧化应激反应,调控肾组织Bax/Bcl-2的平衡,下调凋亡相关信号蛋白的表达,抑制肾组织E-cadherin的降解和丢失而阻滞过度训练所致的肾组织细胞凋亡,减轻急性肾损伤,明显提高大鼠的运动能力。三种药物对OTIAKI均具有良好的肾脏保护作用,在作用效果上,山莨菪碱、旋覆花素比苦碟子更明显,这可能与它们作用的分子靶点及其作用程度不同有关。


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