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人牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞生物学活性的实验研究

王琨  
【摘要】: 目的:牙周组织包括牙龈、牙周膜及矿化组织牙骨质和牙槽骨,主要作用是支持稳固牙齿。由于其组成的多样性,使牙周组织愈合比一般的软组织愈合更为复杂。成纤维细胞是牙龈结缔组织和牙周膜的主要细胞类型,在牙周组织的形成与再生、完整性的维持及功能的实施中起重要作用。有研究认为牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)和牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts , GFs)虽然在光镜下与扫描电镜下观察其在形态上没有区别,但在功能上具有明显的差异:牙龈成纤维细胞主要与牙龈组织的自身稳定有关,而牙周膜细胞除维持自身的稳定外,还可分化成成骨细胞和成牙骨质细胞参与邻近牙槽骨和牙骨质的改建及修复再生。目前尚缺乏明确的区别牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞的细胞标志物。 牙周病是人类常见病、多发病,发病率高达80%以上。患病后常导致牙周组织结构破坏,牙周附着丧失、牙周袋形成、牙齿松动甚至脱落,是导致成年人失牙的主要原因。牙周病手术治疗后,牙周组织的愈合趋向于牙周各种细胞成分的竞争性生长,只有牙周膜细胞首先占据牙根面,才能形成真正意义的牙周组织再生;将体外培养的牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞植入动物体内,发现牙龈成纤维细胞不能形成新的牙周再生所需的各种组织,多为纤维性愈合,而牙周膜细胞则可形成再生性愈合。 本实验采用体外原代培养人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,四唑盐比色法(MTT)比较二者的增殖特性、检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性,免疫组化染色法对比两种细胞对于Ⅰ、Ⅲ型胶原、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)的表达情况,流式细胞术(flow cytometry,FCM)比较两种细胞中BMP水平的表达。为深入研究牙周组织中各种细胞的生物学特性、进一步找出牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞的鉴别标志提供理论基础,并为今后改良两种细胞使其成为牙周组织工程的理想种子细胞奠定基础。 方法:采用组织块法分离培养牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,测定二者的增殖特性和ALP活性,利用免疫组化和FCM方法比较Ⅰ、Ⅲ型胶原、BMP的表达情况,以观察对比两种细胞的生物学特性的异同。 1原代培养及传代 体外人牙周膜细胞原代培养:取临床上12岁左右因正畸需要拔除的健康前磨牙,刮取牙根中1/3的牙周膜组织,利用组织块法培养牙周膜细胞,当细胞生长至铺满瓶底80%时进行传代。取第二代细胞爬片,鉴定细胞来源。体外人牙龈成纤维细胞原代培养:取同一个体同一部位的龈乳头组织,按上述相同方法进行牙龈成纤维细胞培养。 2增殖活性的比较 取第四代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞,以2×10~4/ml的细胞浓度接种于3个96孔培养板,10% DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培养基共培养7 d,分别于第3、5、7d,各取出一个96孔板, MTT法于酶标仪上492 nm波长读取A值。 3 ALP活性比较 取第五代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞,以1×105/ml的细胞浓度接种于24孔培养板,10% DMEM培养基共培养7 d,弃孔内液体,加入Triton X-100,4℃过夜,进行如下实验:取上述各孔液体及空白对照的蒸馏水一并转入另一96孔板。按ALP试剂盒说明依次按比例加入缓冲液、基质液,水浴,加入显色剂后在酶标仪上于410 nm波长下测得OD值,间接反映细胞ALP活性。 4免疫组化染色 取第五、六代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞,以2×105/ml的细胞浓度接种于放有1×1cm2大小盖玻片的12孔培养板中,加入10% DMEM培养基培养一周,95%乙醇固定后进行免疫组化染色,光学显微镜下观察。结果判定:细胞胞浆中有棕色颗粒为阳性。以染色强度为判定标准,分为四级:无棕色颗粒记为(-);仅有少量、细小、散在的棕色颗粒,着色较浅,记为(+);棕色颗粒聚集成大颗粒记为(++);颗粒密集成团片状,着色深棕,记为(+++)。 5流式细胞学检测 取第六代牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞,经胰蛋白酶消化吹散,计数细胞量达1×106个以上,离心收集细胞,D-Hank’s液洗两次,70%乙醇固定同时吹散成单细胞悬液,上机进行FCM检测。 结果 1人牙周膜细胞原代培养成功率为10%,牙龈成纤维细胞的原代培养成功率为100%,倒置相差显微镜下观察,5~10 d有细胞从组织块周围游出,放射状排列,20 d细胞长满培养瓶底,原代及传代培养的牙龈与牙周膜细胞在相差显微镜下形态相似,均为梭形,有2~3个胞浆突起,胞核呈圆形或椭圆形,核仁明显。经免疫组化鉴定波形蛋白阳性,细胞角蛋白阴性,符合成纤维样细胞的特征。 2加入MTT 4 h后,各孔内均有紫黑色结晶形成,经酶标仪于492 nm处读数,结果显示牙龈成纤维细胞的A值明显高于牙周膜细胞,P0.01。 3 ALP检测结果显示,牙周膜细胞ALP的OD值高于牙龈成纤维细胞,P0.01。 4免疫组化染色:以阴性对照为参照,牙周膜细胞中Ⅰ型胶原染色均为阳性,(++)~(+++),胞浆中充满棕黄色大颗粒,核膜周围染色较深,而牙龈成纤维细胞为(+),染色较弱,颗粒细小,胞浆淡黄色。Ⅲ型胶原的染色结果牙周膜细胞为阳性,(++)~(+++),牙龈成纤维细胞则着色较淡(+)。BMP在牙周膜细胞中深棕色颗粒密集成团片状,为(+++),而牙龈成纤维细胞着色较淡,为(+)。 5流式细胞学检测:牙周膜细胞中BMP的荧光强度值高于牙龈成纤维细胞,P0.01。 结论 1与牙周膜细胞相比,牙龈成纤维细胞取材容易,原代培养成功率高,细胞增殖活性强,进一步研究后可作为牙周组织工程的种子细胞大量使用。 2免疫组化染色显示,Ⅰ、Ⅲ型胶原在体外培养的牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞中的表达不同,牙周膜细胞表达均为中到强阳性,而牙龈成纤维细胞中为弱阳性,表明两种细胞在胶原基质合成方面存在差异。Ⅰ、Ⅲ型胶原可作为鉴别两种细胞的标志物。 3牙周膜细胞表达的ALP活性高于牙龈成纤维细胞,免疫组化染色及FCM检测均显示牙周膜细胞的BMP表达高于牙龈成纤维细胞,ALP与BMP可作为鉴别两种细胞的标志;同时提示牙周膜细胞与牙龈成纤维细胞相比,具有较强的成骨能力,是理想的牙周组织工程的种子细胞。


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