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《河北医科大学》 2008年
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应用siRNA敲低MMP-9基因表达后对人U251胶质瘤细胞增殖和侵袭作用的体内外研究

宋剑  
【摘要】: 脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,由于呈侵袭性生长,增殖速度快,现有的综合治疗措施如外科手术切除、术后放疗、化疗和免疫治疗难以达到根除,复发率很高,严重影响生存质量和生存期,其临床预后甚差。随着肿瘤生物学和分子遗传学理论与技术的发展,目前已认识到,胶质瘤是一种多基因异常疾病,和人体其他部位的肿瘤一样,胶质瘤发生发展主要是原癌基因的激活与抑癌基因的失活并由此产生一系列基因异常和动态演进的结果,因此寻找与胶质瘤发病相关的基因,深入了解胶质瘤的分子病理,在此基础上开拓胶质瘤治疗的新策略和靶点,成为胶质瘤研究领域的一项重要内容;由此,纠正与胶质瘤发生、发展相关的基因异常的基因治疗也成为医学研究领域的前沿课题,为国内外胶质瘤研究热点之一。 本课题重点研究了胶质瘤中MMP-9的异常表达以及应用RNA干涉技术干预MMP-9在胶质瘤中的表达对胶质瘤恶性表型的影响。课题分三部分进行: 第一部分中应用免疫组织化学的方法以49例胶质瘤临床标本和4例正常脑组织为研究对象,对MMP-9蛋白异常表达情况进行初步筛选和验证,观察MMP-9蛋白在不同级别脑胶质瘤表达情况,探讨MMP-9异常表达与肿瘤恶性程度之间的关系,研究MMP-9表达与脑胶质瘤侵袭的相关性。 第二部分则侧重于在体外应用RNA干涉技术以oligofectamine介导MMP-9 siRNA靶向转染人脑胶质母细胞瘤U251细胞系后,应用PCR检测目的基因的敲低情况,并用Western blot和免疫荧光技术检测了RNAi敲低MMP-9的表达后,MMP-9蛋白的表达变化。并用细胞生长曲线、MTT、流式细胞术及Matrigel 2D、3D生长实验、Transwell侵袭实验等方法分析了转染前后细胞增殖、细胞周期分布和侵袭能力的变化。 第三部分中则通过建立裸鼠胶质瘤皮下动物模型,在荷瘤裸鼠瘤内注射oligofectamine和MMP-9siRNA的混合物,动态观察体内转染MMP-9 siRNA后肿瘤生长情况,应用免疫组织化学方法检测RNA干涉技术敲低U251裸鼠胶质瘤MMP-9基因的表达后该蛋白的表达变化,对体外实验的结果进一步验证。 结果 第一部分MMP-9在人脑胶质瘤中的表达增高,且随肿瘤恶性程度的升高其表达丰度呈现上升现象,MMP-9阳性表达率与胶质瘤恶性程度成正相关。 第二部分半定量PCR以及Western blotting检测显示应用RNA干扰技术以MMP-9siRNA敲低人胶质母细胞瘤细胞系U251中MMP-9基因表达后,MMP-9的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制。细胞生长曲线、MTT检测肿瘤细胞增殖能力显示转染MMP-9siRNA组的U251细胞增殖能力明显下降;流式细胞术检测细胞周期结果显示MMP-9基因表达被抑制后,U251细胞生长出现抑制,出现G0/G1阻滞;2D、3D生长试验和Transwell侵袭实验证实转染MMP-9siRNA后U251细胞水解模拟基质胶能力明显下降,导致细胞侵袭性生长能力受到抑制,其体外侵袭能力与对照组相比明显降低,且具有统计学意义(P0.001)。 第三部分以瘤组织块接种法成功建立U251胶质母细胞瘤细胞系裸鼠皮下肿瘤模型,每4天测量一次肿瘤体积,并在肿瘤局部多点注射MMP-9siRNA和oligofectamine混合物进行体内转染,发现和对照组相比,MMP-9 siRNA治疗组肿瘤生长缓慢,从治疗后的第4天起,肿瘤体积出现明显差别,这种差别在观察末期(28天)最显著,差别具有统计学意义(P0.001);对照组和nonsene siRNA转染组部分动物肿瘤有明显的出血,液化和坏死,符合恶性胶质瘤生长的特点,而MMP-9 siRNA治疗组肿瘤均为实体性,无明显液化,局部区域有零星坏死灶。应用免疫组化法检测肿瘤标本,发现转染组MMP-9的蛋白表达明显降低,有统计学意义(P0.001)。体内和体外实验的结果一致。 结论 1.胶质瘤中MMP-9的过表达与细胞增殖和侵袭密切相关。胶质瘤中随着MMP-9表达增高呈现恶性程度增高的现象。 2.应用RNA干涉技术以Oligofectamine介导靶向转染MMP-9 siRNA可有效敲低这个基因在人胶质母细胞瘤U251细胞系内的表达,降低MMP-9蛋白酶的活性,从而抑制了细胞的增殖和侵袭,出现G0/G1期阻滞。 3.裸鼠皮下胶质瘤模型应用Oligofectamine介导的MMP-9siRNA治疗,同样可有效敲低MMP-9的表达,抑制MMP-9的活性,从而抑制肿瘤的生长与侵袭,与体外试验结果一致。 4.MMP-9可成为基因治疗的侯选基因,RNA干涉是一项有效的基因沉默的新技术,有潜在临床应用前景。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R739.4

【参考文献】
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