收藏本站
《河北医科大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

一种骨桥蛋白小分子肽的重组表达与生物学活性研究

刘颖慧  
【摘要】: 目的:血管损伤部位新生内膜的形成是动脉粥样硬化(AS)和血管成形术后再狭窄(PTCA)病理过程中的重要事件之一,当血管内膜受损时,位于血管中膜的血管平滑肌细胞(VSMC)在生长因子和细胞因子的刺激下由收缩表型转化为合成表型,并获得向内膜下迁移、增殖及合成和分泌大量细胞外基质(ECM)的能力。VSMC迁移主要是由ECM蛋白和细胞表面整合素受体(主要是αvβ3)相互作用所介导的。已经证明,在各种ECM蛋白中,骨桥蛋白(OPN)与细胞迁移和黏附的关系最为密切。OPN通过它所含有的RGD序列与整合素αvβ3、αvβ5相互作用,通过SVVYGLR序列与整合素α9β1、α4β1结合。已经证实,含RGD和SVVYGLR序列的短肽能够竞争性的抑制OPN与多种整合素的结合,从而抑制VSMC以及炎性细胞的黏附和迁移。以小分子肽作为阻断剂研究蛋白质的功能是揭示细胞活动调节机制的重要手段。本实验利用基因重组技术,将含有编码RGD序列的cDNA片段与携带2×His-Trx-S·tag编码序列的原核表达载体pET-32c(+)重组,构建pET-32c-RGD重组子,将其转化大肠杆菌BL21(DE3) ,表达产物为His-Trx-S·tag-RGD融合蛋白(简称His-RGD)。经分离纯化后获得His-RGD纯品,该短肽可作为阻断剂用于研究OPN在体内的生物学作用。 方法: 1重组表达质粒的构建与鉴定 将编码RGD13肽的DNA(以下简称RGD)片段经NcoⅠ/BamH I酶切位点克隆入pET-32c(+)载体,构建His-RGD融合蛋白表达质粒。通过双酶切和序列分析对重组质粒进行鉴定。 2 His-RGD融合蛋白在大肠杆菌中的表达 2.1 His-RGD融合蛋白的诱导表达 将pET-32c-RGD转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同条件下,用IPTG诱导后可检测His-RGD融合蛋白的表达活性,并对IPTG浓度、诱导时间和诱导温度进行筛选优化,确定His-RGD融合蛋白诱导表达的最佳条件。表达产物经SDS-PAGE检查融合蛋白在细胞中的存在形式。 2.2 His-RGD融合蛋白的分离纯化 取含有表达产物的细菌裂解液上清直接经Ni-NTA His Bind Resin金属离子螯合层析进行纯化。 3 His-RGD融合蛋白生物学活性检测 3.1黏附抑制实验 取3-4代体外培养的VSMC分别与0、150、300、450 mg/L的His-RGD融合蛋白预孵育1 h,然后将细胞接种到用BSA (20 mg/L)或OPN (20 mg/L)包被的96孔板中,检测单位时间( 2h )内黏附至孔板上的细胞数,以此表示细胞黏附活性。以融合蛋白洗脱液和2×His-Trx-S·tag蛋白作为平行对照,以确定His-RGD抑制细胞黏附的特异性。 3.2伤口愈合实验 将VSMC接种于带有玻片的孔板内,待细胞生长至100%汇合后,分别加入0、150、300、450 mg/L的His-RGD预孵育1 h。取出玻片,用无菌吸头在玻片上划痕。随即将玻片放回孔板内,每孔加入20 mg/L OPN或20 mg/L BSA 100μl,继续孵育24 h后,于低倍镜下观察细胞伤口愈合程度,以此表示细胞的迁移活性。以融合蛋白洗脱液和2×His-Trx-S·tag蛋白作为平行对照,以确定His-RGD抑制细胞迁移的特异性。 结果: 1重组表达质粒pET-32c-RGD的构建与鉴定 重组表达质粒经NcoI和BamHI双酶切,产物经核酸电泳鉴定时出现长度为50 bp的插入片段,与预期结果相一致。测序结果显示插入片段的核酸序列正确无误。重组质粒命名为pET-32c-RGD。 2 His-RGD融合蛋白的诱导表达 转化pET-32c-RGD的宿主菌经IPTG诱导后可表达约18.71 kD的蛋白质,与His-RGD融合蛋白分子量相一致,该融合蛋白主要以可溶性蛋白形式存在于胞浆。取培养物(OD600=0.6)按1:50接种于含0.01 mmol/L IPTG的LB培养液中,25℃诱导培养7 h时,His-RGD融合蛋白的表达量最大,此条件作为His-RGD融合蛋白诱导表达的最佳条件。 3 His-RGD融合蛋白的纯化 经Ni-NTA His Bind Resin金属离子螯合层析进行纯化后,每100 ml培养物可得到约25 mg电泳纯的可溶性His-RGD融合蛋白,纯度为95%。 4 His-RGD融合蛋白对细胞黏附的影响 黏附抑制实验结果显示,在所观察的浓度范围内,His-RGD融合蛋白能剂量依赖性的抑制VSMC在OPN包被板上的黏附,在融合蛋白为450 mg/L时,抑制效果最明显。 5 His-RGD融合蛋白对细胞迁移的影响 伤口愈合实验结果表明,His-RGD能剂量依赖性的抑制VSMC迁移,在融合蛋白为450 mg/L时,抑制效果最明显。 结论: 1成功构建了含有OPN RGD序列13肽基因单拷贝的pET-32c-RGD原核表达质粒。 2经过对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间等条件进行优化,His-RGD融合蛋白在大肠杆菌中得到有效表达。 3每100 ml培养物经亲和层析纯化可得到约25 mg电泳纯的可溶性融合蛋白,纯度为95%。 4 His-RGD融合蛋白能够剂量依赖性的抑制OPN诱导的VSMC的黏附与迁移。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78

免费申请
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 李家大,王克夷;从噬菌体多肽文库中筛选α-葡萄糖苷酶的抑制剂[J];生物化学与生物物理学报;2001年05期
2 郝文波,徐伟文,陈白虹,王萍,董文其,李明;噬菌体展示ICAM-1模拟肽的制备及活性鉴定[J];细胞与分子免疫学杂志;2003年01期
3 刘智敏,韩梅,温进坤;细胞外基质促血管平滑肌细胞迁移及β_3整合素和粘着斑激酶表达[J];中国病理生理杂志;2003年02期
4 柴锡庆,郑斌,韩梅,杨淑丽,温进坤;骨桥蛋白的制备及功能研究[J];中国老年学杂志;2004年08期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 杨松;周建中;陈永宏;;阿托伐他汀钙对肾性高血压大鼠骨桥蛋白的影响[J];北京大学学报(医学版);2010年02期
2 赵岩龙;沈兴家;郭锡杰;;家蚕抗菌肽moricin在大肠杆菌中的融合表达及抗菌活性测定[J];蚕业科学;2008年02期
3 汤轶;刘建新;金龙玉;;整合素β1、β3与肺癌转移的相关研究进展[J];中国医师杂志;2006年02期
4 王鑫鑫;钱远宇;孟庆义;沈洪;;小分子直接凝血酶抑制剂阿加曲班在急性冠脉综合征中的应用[J];中国医药导刊;2009年01期
5 胡建恩;马驰宇;王刚;曲敏;谢智芬;王佳培;佟长青;;牡蛎蛋白水解产物中α-葡萄糖苷酶活性抑制组分的分离与纯化[J];大连水产学院学报;2009年05期
6 孙长义,步星耀;人脑胶质瘤骨桥蛋白的表达[J];第四军医大学学报;2005年18期
7 刘相叶;邓洪宽;吴秀萍;王学林;于申业;于艳玲;刘明远;;噬菌体展示技术及其应用[J];动物医学进展;2008年01期
8 狄柯坪;韩梅;温进坤;;旋覆花素抑制血管内皮剥脱诱导的粘附分子表达[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2007年02期
9 岳永玉;尹慧清;;骨桥蛋白在人脑胶质瘤中的表达[J];实用诊断与治疗杂志;2006年07期
10 单丽,徐杰诚,夏宗芗,李家大,王克夷;基于计算机模拟的拟糖三肽的设计与合成[J];化学学报;2004年02期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 章玉萍;范涛;代君君;王储炎;吴传华;刘健;;家蚕抗菌肽Cecropin D基因的原核表达、纯化及抑菌活性测定[A];中国蚕学会第八届暨国家蚕桑产业技术体系家(柞)蚕遗传育种及良种繁育学术研讨会论文集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵文红;以血管平滑肌细胞为靶标的抗动脉粥样硬化功效成分筛选及其作用机制初探[D];南昌大学;2011年
2 刘智敏;整合素β_3-FAK信号途径活化与血管平滑肌细胞迁移的关系及作用机制[D];河北医科大学;2003年
3 程云会;血管平滑肌细胞SM22α的表达调节及其功能研究[D];河北医科大学;2004年
4 许丽辉;血清应答因子在血管平滑肌细胞表型重塑过程中的表达与修饰研究[D];河北医科大学;2005年
5 郝玉宾;整合素β_3与PDGF受体交谈调节血管平滑肌细胞粘附和增殖的作用机制[D];河北医科大学;2004年
6 范哲;过量氟对几种非胶原蛋白和转化生长因子β表达的影响[D];吉林大学;2006年
7 李菁菁;骨桥蛋白与整合素相互作用调节血管平滑肌细胞黏附和迁移的分子机制[D];河北医科大学;2006年
8 方俊;猪血多肽的制备及其生物活性研究[D];湖南农业大学;2006年
9 苗莉;AT2R基因在体可调控表达抑制大鼠颈动脉损伤后新生内膜形成的实验研究[D];第三军医大学;2007年
10 汪永义;骨桥蛋白下调对大隐静脉平滑肌细胞多种生物学特性影响的实验研究[D];中南大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 岳锋;猪瘟病毒感染靶细胞的配体表位研究[D];河南科技学院;2010年
2 卢翠侠;CTGF-整合素α_vβ_5受体信号途径在PASMC增殖、迁移、细胞骨架改变和细胞外基质基因表达中的作用[D];泸州医学院;2011年
3 张晖;用噬菌体展示技术筛选Gal-α1,3-Gal的模拟肽[D];浙江大学;2003年
4 赵洪波;以寡糖模拟肽鉴定细胞表面L-选择蛋白表达的新方法[D];大连医科大学;2004年
5 凌宏艳;罗格列酮对胰岛素抵抗大鼠主动脉内皮功能的保护作用及机制[D];南华大学;2005年
6 金晓蕾;脂代谢相关三基因突变小鼠模型动脉粥样硬化机理研究—蛋白质组学分析[D];浙江大学;2005年
7 吴红玉;骨桥蛋白RGD多拷贝短肽的表达、纯化及生物学活性研究[D];河北医科大学;2006年
8 宋兴辉;1. 肽链延伸因子的表达特征 2. 脂代谢相关基因小鼠肝脏差异表达蛋白研究[D];浙江大学;2006年
9 王炳香;罗格列酮对高糖诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖与基质合成的影响及机制[D];南华大学;2006年
10 何庆华;采用噬菌体展示技术淘选玉米赤霉烯酮模拟表位的研究[D];南昌大学;2006年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
1 周秀霞,温进坤,韩梅;白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α对血管平滑肌细胞及基质金属蛋白酶-2骨桥蛋白基因表达的影响[J];中国动脉硬化杂志;1999年04期
2 韩梅,温进坤;细胞因子对血管平滑肌细胞MMP-2基因表达的诱导及其作用机制研究[J];中国生物化学与分子生物学报;2000年02期
3 韩梅,温进坤,李相印,周秀霞;不同时相血管平滑肌细胞受促分裂原刺激后基因表达谱及迁移活性的比较[J];中国生物化学与分子生物学报;2000年06期
4 李琦,温进坤,韩梅;血管再狭窄发生过程中SMα肌动蛋白和SMemb基因表达的变化及其影响机制研究[J];中国生物化学与分子生物学报;2000年06期
5 刘智敏,韩梅,温进坤;细胞外基质促血管平滑肌细胞迁移及β_3整合素和粘着斑激酶表达[J];中国病理生理杂志;2003年02期
6 聂磊,韩梅,温进坤;血管内膜增生过程中核酸代谢相关酶活性变化的研究[J];中国应用生理学杂志;2003年03期
7 甘永华;细胞粘附分子与疾病[J];中国兽医科技;1999年11期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 范哲,李鸿雁,龙毅,刘娅;骨桥蛋白的研究进展[J];中国实验诊断学;2005年02期
2 周万军,柳永和;骨桥蛋白与细胞免疫[J];国外医学.生理.病理科学与临床分册;2004年06期
3 臧敬五;自身免疫性疾病研究的新进展——骨桥蛋白在类风湿性关节炎中的病理机制研究[J];中国科学院院刊;2005年03期
4 黄仕和,许四宏,李云春;骨桥蛋白的生物学功能[J];生命的化学;2001年05期
5 姜学军,冯陶,常连胜,郭应禄;骨桥蛋白在人肾和鼠肾中的表达[J];中华医学杂志;1998年11期
6 杨恬,向明明;大鼠皮肤及毛囊骨桥蛋白研究[J];中国医学科学院学报;2000年03期
7 孙爱军;骨桥蛋白在血管重塑中的作用[J];国外医学.生理.病理科学与临床分册;2001年06期
8 刘思金,胡国法,刘思国,魏影允,薛延,劳为德;人类骨桥蛋白(hOPN)在细胞增殖中的功能研究[J];高技术通讯;2003年02期
9 姜宏华,张一楚;骨桥蛋白与肿瘤(文献综述)[J];国外医学.外科学分册;2000年04期
10 石磊;王韶;刘晓梅;程舸;于雷;段芳芳;韩丽华;;骨桥蛋白中多肽片段的FT-ICR-MS分析[J];分析测试学报;2008年S1期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘天舒;崔越宏;陈世耀;王吉耀;;不同的胃癌细胞株中骨桥蛋白的表达比较[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
2 王燕燕;马欣然;柳融皎;朱巍;姜晓华;宁光;王曙;;初发Graves病患者血清中骨桥蛋白的表达和意义[A];中华医学会第十次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2011年
3 薛裕华;张晓飞;董琼珠;付丽云;孙健贾;户亮;钦伦秀;;HCC凝血酶的表达与骨桥蛋白阳性患者的总体生存和复发相关[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年
4 胡涛;贾国良;贾林涛;张荣庆;王海昌;李寰;王晓燕;;内皮素对大鼠主动脉平滑肌细胞骨桥蛋白基因表达的影响[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年
5 王莹;;骨桥蛋白及其受体在结石动物模型及细胞模型中的表达[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
6 俞文华;车志豪;张祖勇;许培源;陆镛民;傅林;朱强;陈锋;杜权;;骨桥蛋白在胶质瘤细胞中的表达及其信号传导途径[A];2005年浙江省神经外科学术会议论文汇编[C];2005年
7 刘虹彬;温进坤;韩梅;;丹参对氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2、9和骨桥蛋白表达的影响[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
8 孙威;魏锐利;;骨桥蛋白与眼部疾病的研究进展[A];第六届全国中医中西医结合眼科学术交流会论文汇编[C];2007年
9 杜权;俞文华;许培源;陆镛民;傅林;朱强;张祖勇;车志豪;陈锋;江林涌;董晓巧;;胶质瘤患者外周血骨桥蛋白检测及其临床意义[A];2007浙江省神经外科学学术年会论文汇编[C];2007年
10 鞠吉雨;周群芳;王丽娜;邸大琳;;抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 胡德荣;“骨桥蛋白”是导致类风湿性关节炎顽凶[N];健康报;2005年
2 记者 谢军;类风湿性关节炎研究获重大突破[N];光明日报;2005年
3 胡德荣;类风湿性关节炎研究获重大突破[N];中国医药报;2005年
4 龙岩;新技术让你的皮肤“刀过不留痕”[N];北京科技报;2008年
5 黎彬;肝癌研究重要进展——预测肝癌转移成为可能[N];中国医药报;2004年
6 丁;影响肾功能的一些因素[N];健康报;2005年
7 王雪飞;肝癌乳癌复发转移基因被“捕获”[N];健康报;2004年
8 北京顺义蜂疗所 王孟林;骨关节病治疗的新途径[N];健康报;2009年
9 姜微 秦嗣萃;我国应用肝癌基因谱破解肝癌转移之迷[N];中国医药报;2003年
10 王雪飞;癌症复发转移预测更准了[N];健康报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 薛裕华;凝血酶是治疗转移性骨桥蛋白阳性肝细胞肝癌的靶点[D];复旦大学;2010年
2 刘希胜;骨桥蛋白及其反义基因对肝癌细胞浸润的生物学行为实验研究[D];苏州大学;2004年
3 丁凌;骨桥蛋白在大肠癌肝转移中的表达和功能研究[D];浙江大学;2003年
4 林帆;骨桥蛋白过量表达和肝细胞癌侵袭潜能的关系及RNA干扰对其影响的基础和临床研究[D];广州医学院;2011年
5 郭佳;骨桥蛋白编码基因在原发性肝癌中表达的研究[D];第二军医大学;2004年
6 张国新;HCCR、骨桥蛋白在肝癌等恶性肿瘤发生及侵袭转移中的作用研究[D];南京医科大学;2007年
7 刘健刚;骨桥蛋白与颅咽管瘤预后的相关性研究[D];昆明医学院;2008年
8 唐红卫;OPN在胃癌中的作用及其调节机制研究[D];第四军医大学;2005年
9 印芳颖;骨桥蛋白及其反义基因在病毒性心肌炎中表达及作用的研究[D];吉林大学;2007年
10 郑向阳;RNA干扰技术特异性抑制大鼠VSMC骨桥蛋白基因表达的研究[D];华中科技大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘颖慧;一种骨桥蛋白小分子肽的重组表达与生物学活性研究[D];河北医科大学;2008年
2 王冬梅;骨桥蛋白在子宫内膜异位症发病机制中的研究[D];山东大学;2005年
3 王鸿涵;骨桥蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义[D];中南大学;2010年
4 杨松;骨桥蛋白与高血压血管重构的关系及他汀的干预影响[D];重庆医科大学;2010年
5 段波;骨桥蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达及临床意义[D];第三军医大学;2007年
6 曾凯斌;骨关节炎关节滑液中骨桥蛋白与肿瘤坏死因子-α的含量检测及其意义[D];中南大学;2007年
7 李江华;中耳胆脂瘤组织中骨桥蛋白和基质金属蛋白-9的表达和相关性研究[D];佳木斯大学;2008年
8 黄茜;骨桥蛋白在硬皮病患者皮损中的表达和意义[D];华中科技大学;2008年
9 范燕云;实验性溃疡性结肠炎大鼠肠壁胶原纤维和骨桥蛋白表达变化及相关药物的影响[D];福建医科大学;2010年
10 龚颖;骨桥蛋白在系统性红斑狼疮中的临床意义[D];重庆医科大学;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026