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《河北医科大学》 2009年
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钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子信号通路在大鼠主动脉钙化中的作用

郑敬  
【摘要】: 目的:骨、牙齿之外的非骨性组织发生钙化,伴或不伴组织坏死或损伤,均称为异位钙化。临床上的异位钙化涉及心脏瓣膜钙化、血管钙化、软组织钙化等,近年血管生物学的研究和心血管影像学(如电子光束计算机断层扫描等)的进展,发现血管钙化是动脉粥样硬化、高血压及糖尿病等多种疾病常见的、共同的病理变化,也是形成动脉斑块引起管腔狭窄的重要因素之一。 虽然血管钙化是许多临床疾病的重要特征,然而导致血管钙化发病的确切机制尚不清楚。以往认为血管钙化是衰老时出现的异位骨化,是钙盐在细胞内和细胞外基质的被动沉积。然而新近的许多研究发现,血管钙化并不是磷酸钙结晶在血管壁的简单而被动的沉积,而是一种类似于骨和软骨形成的主动的调节过程,血管细胞(尤其是血管平滑肌细胞vascular smooth muscle cells,VSMCs)由正常的收缩表型转变为成骨细胞样表型,动脉粥样硬化斑块和钙化损伤区含有多种骨基质蛋白和成骨细胞标志物。 钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员,是唯一受Ca~(2+)/钙调素(calmodulin,CaM)调节的磷蛋白磷酸酶。CaN主要表达于细胞浆中,组织分布广泛,通过使其最重要的底物活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFATs)去磷酸化和核内转位,激活下游基因转录,参与多种细胞的功能调节。研究证实CaN/NFATc信号通路在心肌细胞肥大和骨代谢中具有重要作用,还广泛存在于免疫系统,调节淋巴细胞生理性及病理性生长、分化和发育。CaN/NFATc信号通路不仅参与成骨细胞分化和成骨作用,还是破骨细胞分化所必需的,是否参与血管钙化的调节过程,目前国内外尚未见有报道。因此,设想通过此通路调节钙化的血管,改善患者的临床预后,为临床治疗展示了应用前景。 本试验采用华法令和维生素D3建立大鼠血管钙化模型,测定主动脉CaNAα、NFATc mRNA的表达、CaN和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,进行CaNB1和NFATc免疫组化染色,并观察CaN特异性抑制剂环孢霉素A(cyclosporin A,CsA)对CaN/NFATc信号通路表达及血管钙化的影响,初步探讨CaN/NFATc信号通路在血管钙化中的调节作用,为血管钙化的临床防治提供新的思路。 方法:4w SD雄性大鼠36只,体重80~90g,随机分为3组,每组12只。A组:对照组;B组:钙化组;C组:CsA组;实验第1-8天,各组均给予维生素K115m g·kg~(-1)·d~(-1),皮下注射。同时,C组另给予CsA10m g·kg~(-1)·d~(-1)腹腔注射;A组和B组分别给予等量生理盐水腹腔注射。第3天开始,B、C组另给予维生素D_3 3×10~5U·kg~(-1)·d~(-1),皮下注射,持续至实验第5天,及华法令15mg·100g~(-1),12h一次,皮下注射,持续至第8天;对照组在相同时间给予等量生理盐水皮下注射。实验第9天,所有动物麻醉后处死。开胸,暴露出心脏,分离胸主动脉,并向下剖开腹部,分离出腹主动脉,从主动脉根部至腹主动脉分叉处剪下主动脉。 取材后每组各取6只用于进行CaNB1和NFATc免疫组化染色,原位杂交测定CaNAα和NFATc mRNA。6只用于组织CaN、ALP活性测定。将免疫组织化学和原位杂交结果应用Image-Pro Plus图象分析软件,分别计算各组主动脉组织相同面积内阳性细胞的累积光密度值(integrated optic density,IOD)。所有数据以均数±标准差( x±s)表示,运用SPSS 13.0统计软件,首先对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验,组间资料比较应用单因素方差分析,两两比较应用LSD-t检验,P0.05即有统计学意义。 结果:(1)HE染色结果示对照组大鼠主动脉壁结构完整,中层VSMCs排列整齐;钙化组和CsA组大鼠主动脉中层VSMCs排列紊乱,弹力纤维迂曲断裂。VonKossa染色示钙化组大鼠主动脉中层弹性纤维间有大量黑色颗粒沉积;CsA组大鼠主动脉中层弹性纤维间亦可见黑色颗粒沉积;对照组未见明显黑色颗粒沉积。(2)免疫组织化学结果示对照组大鼠主动脉可见少量CaNB1、NFATc蛋白表达,主要位于胞浆内;钙化组大鼠主动脉CaNB1、NFATc蛋白较对照组表达明显增加;CsA组大鼠主动脉CaNB1、NFATc蛋白较对照组达明显增加,较钙化组表达减少。(3)原位杂交结果显示对照组大鼠主动脉可见CaNAα、NFATc mRNA表达,主要位于胞浆中;钙化组大鼠主动脉CaNAα、NFATc mRNA较对照组表达明显增加;CsA组大鼠主动脉CaNAα、NFATc mRNA较对照组表达明显增加,较钙化组表达明显减少。(4)钙化组CaN活性较对照组明显增加;CsA组CaN活性较对照组明显增加;CsA组CaN活性与钙化组比较无显著性差异。(5)钙化组ALP活性较对照组增加;CsA组ALP活性较对照组明显增加,与钙化组比较无显著性差异。 结论:1.本实验采用华法令和维生素D3皮下注射成功地建立了大鼠主动脉钙化模型,并且在透射电镜下观察了钙化大鼠主动脉超微结构的变化。2.本试验首次发现钙化大鼠主动脉中CaN的活性,CaN、NFATc mRNA和蛋白的表达明显增加,说明CaN/NFATc信号通路参与血管钙化的调节过程。3.免疫抑制剂CsA很可能促进血管钙化。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R543.1

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