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《河北医科大学》 2009年
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大黄素对白血病细胞K562、U937的增殖抑制及机制初探

张丛丛  
【摘要】: 目的:白血病(Leukemia)是一类造血干细胞的克隆性疾病,这些白血病细胞失去正常的成熟分化能力而停滞在细胞发育的某一阶段,在骨髓和其他造血组织中白血病细胞大量增殖聚集,并浸润其他组织器官,使正常造血功能受到抑制。我国白血病的发病率约为2.76/10万。在恶性肿瘤所致的死亡率中,白血病居第6位(男性)和第8位(女性),但在儿童则居第一位。尽管不断有新的化疗药物问世、并用于白血病的治疗,造血干细胞移植技术也在不断提高,但目前仍有许多白血病患者不能取得完全缓解或在完全缓解后复发。原发或继发耐药及多药耐药的出现更增加了白血病治疗的难度。因此,对于血液工作者而言,寻找新的有效治疗白血病的药物和有效的治疗方案已经成为一项长期艰巨的任务。 大黄素(Emodin,EM)是一种羟基蒽醌类化合物。它具有抗炎抑菌、免疫调节、抗胰酶、保护肝肾功能、抗肿瘤等生物活性,特别是大黄素的抗肿瘤作用,成为近年研究热点。它通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、影响细胞信号转导途径和影响细胞周期、逆转多药耐药等机制发挥其抗肿瘤作用。 本文主要观察不同浓度的大黄素对白血病细胞株K562、U937的增殖抑制作用,在细胞水平通过荧光显微镜和流式细胞仪检测不同浓度大黄素对两种细胞的形态学、细胞周期及凋亡率的影响,在分子水平上通过RT-PCR技术检测不同浓度大黄素对两种细胞内bcl-2及NF-κB基因表达的影响,从而探讨大黄素抑制白血病细胞株K562、U937增殖的有关机制。 方法: 1细胞培养:将K562、U937细胞按常规用RPMI 1640培养液培养,培养液内含10%新生牛血清(FBS)、100μg/mL青霉素、100U/mL链霉素和2mmol/L谷氨酰胺。置37℃,饱和度5%CO2环境下培养、传代,每2-3天传代一次。待细胞进入对数生长期后进行实验。 2细胞增殖抑制实验:分别测定不同浓度大黄素对K562、U937细胞作用48小时的增殖抑制率。取对数生长期的细胞加入不同浓度的大黄素,培养48小时后,加入CCK-8试剂。在相同条件下继续培养4小时后,在450nm波长下检测吸光度。根据吸光度(A值)计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%。 3荧光染色观察细胞形态改变:分别收集IC50浓度的大黄素作用48h的K562、U937细胞,同时设立不加大黄素的空白对照组。将细胞用PBS洗后重悬,加入Hochest 33342荧光试剂染色。置荧光显微镜下计数400个细胞,观察细胞的形态学变化。 4流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡率:取对数生长期的K562、U937细胞,加入不同浓度的大黄素作用于K562、U937细胞,48h后收集细胞,PBS洗后用70%乙醇4℃固定细胞,PBS再洗后加入RNA酶,10分钟后用终浓度为50μg/ml的PI染色30 min。流式细胞仪测定细胞周期,计算细胞周期变化及凋亡率。 5酶标仪检测caspase3/7活性:将K562、U937细胞接种于96孔板上。处理组的培养液中加入大黄素,使大黄素终浓度为IC50浓度。在37℃、5%CO_2体积分数的条件下培养48h后,加入100μl caspase3/7试剂,4h后酶标仪检测各组细胞在405nm处的吸光度(A值)。 6 RT-PCR检测bcl-2、NF-κB的表达:Trizol法提取细胞总RNA,采用随机引物法以M-MLV合成cDNA,以特异的引物扩增目的基因,琼脂糖凝胶电泳后Goldview染色,以β-action为内参,分析mRNA相对表达水平。 结果: 1大黄素能抑制K562、U937细胞生长并具有浓度依赖性,对K562细胞的IC50为51.58μmol/L,对U937细胞的IC50为48.00μmol/L。 2大黄素处理后,荧光显微镜下出现荧光标记的细胞增多,呈现亮蓝色。 3流式细胞仪检测结果:大黄素处理后,K562细胞主要表现为S期细胞增多、G0/G1期及G2/M期细胞减少(P0.05);U937细胞主要表现为G0/G1期细胞增多、G2/M期及S期细胞减少(P0.05)。两种细胞的凋亡率也随浓度的增加而增加(P0.05)。 4酶标仪检测caspase3/7活性:大黄素处理后K562、U937细胞内的caspase3/7酶活性增加,与对照组相比有显著性差异(P0.05)。 5 RT-PCR检测bcl-2、NF-κB的表达:大黄素处理后,K562、U937细胞内的bcl-2、NF-κB的表达均较对照组下调。 结论:大黄素对K562细胞、U937细胞生长抑制作用明显,可能通过下调bcl-2、NF-κB的表达,使细胞周期进程被阻滞,同时还促进肿瘤细胞发生凋亡。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R733.7

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