收藏本站
《河北医科大学》 2010年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

他汀类药物对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用及其信号转导通路研究

王倩  
【摘要】: 慢性充血性心力衰竭(CHF)是各种心脏疾病发展的终末阶段,其发病率和病死率随着全球老龄化的不断加剧逐年增多。目前虽有多种药物可改善心衰患者症状,但真正能够阻断甚至逆转心衰进程的疗法或药物尚未问世。因此,关于心衰的发病机制和治疗的研究仍在不断深入。 他汀类药物是临床上应用广泛的降脂药,有研究表明,他汀对心衰患者可能有益。本研究以培养的新生SD大鼠心肌成纤维细胞(CFs)为研究对象,采用比色法、流式细胞术、Western Blot和细胞免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描技术等实验方法,观察了醛固酮(Ald)诱导的心脏成纤维细胞增殖、DNA合成、胶原合成及细胞周期变化,及可能的分子机制;同时观察HMG-CoA还原酶抑制剂阿托伐他汀(Ato)对Ald诱导的心脏成纤维细胞增殖、DNA合成、胶原合成及细胞周期变化的影响及其可能的分子机制;还应用比色法和形态学观察、流式细胞术等凋亡检测方法,分别测定了Ato和瑞舒伐他汀(Ros)对CFs增殖和凋亡的影响;并对脂溶性的Ato和水溶性的Ros对心肌成纤维的抑制作用进行了比较。为阐明心肌纤维化的发生机制,防治心肌纤维化提供实验依据。实验内容主要包括以下五部分: 第一部分醛固酮对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的促进作用及其信号转导通路 目的:研究Ald对SD乳鼠CFs增殖和胶原合成的促进作用及其作用机制。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,以Ald诱导其增殖和胶原合成,并加入螺内酯(Spi)干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,流式细胞术检测CFs细胞周期,羟脯氨酸试剂盒检测CFs胶原合成,免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜扫描半定量p-ERK1/2、p-AKT、Cyclin D1、Cyclin E2的表达变化。 结果:1. Ald和Spi对CFs增殖的影响:MTT结果表明,与对照组比较,10~(-9) mol/L~10~(-7) mol/L Ald组的平均吸光度值均显著升高(P 0.05,P 0.05,P 0.01)。10~(-10) mol/L Ald组的平均吸光度值与对照组比较没有显著差异。10~(-9) mol/L~10~(-7)mol/L Ald组同时给予10~(-6 mol/L Spi,平均吸光度值均明显低于相应Ald组(P 0.05,P 0.05,P 0.01),而与对照组比较没有显著差异。10~(-10) mol/L与10~(-9) mol/L、10~(-9) mol/L与10~(-8) mol/L、10~(-8) mol/L与10~(-7) mol/L之间均无显著差异。10~(-10) mol/L Ald组同时给予10~(-6) mol/L Spi,平均吸光度值无显著变化,与对照组比较也无显著差异。 2. Ald和Spi对CFs DNA合成的影响:Brdu结果表明,与对照组比较,10~(-9) mol/L~10~(-7) mol/L Ald组的平均吸光度值均显著升高(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。10~(-9mol/L~10~(-7) mol/L Ald组同时给予10~(-6mol/L Spi,平均吸光度值均明显低于相应Ald组(P 0.01,P 0.01,P 0.01),而与对照组比较没有显著差异。10~(-7) mol/L Ald组的平均吸光度值明显高于10~(-8) mol/L Ald组(P 0.05),10~(-8) mol/L与10~(-9) mol/L Ald组间吸光度值没有显著差异。 3. Ald和Spi对CFs细胞周期的影响:采用流式细胞术对CFs细胞周期进行分析,结果表明:1)G1期细胞百分比:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h的G1期细胞百分比均显著减少( P 0.01,P 0.01,P 0.01)。同时给予10~(-6) mol/L Spi组的G1期细胞百分比均明显高于相应Ald组(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。10~(-7 mol/LAld作用48 h组的G1期细胞百分比明显低于24 h组(P 0.01),10~(-7mol/LAld作用72 h组的G1期细胞百分比明显低于48 h组(P 0.01)。 2)S期细胞百分比:与对照组比较, 10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h的S期细胞百分比均显著增加(P 0.01, P 0.01, P 0.01)。同时给予10~(-6) mol/L Spi组的S期细胞百分比均明显低于相应Ald组(P 0.01, P 0.01, P 0.01)。10~(-7mol/LAld作用48 h组的S期细胞百分比明显高于24h组(P 0.01),10~(-7mol/LAld作用72 h组的S期细胞百分比明显高于48 h组(P 0.01)。 3)PI:与对照组比较, 10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h的PI均显著增加(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。同时给予10~(-6) mol/L Spi组的PI均明显低于相应Ald组(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。10~(-7) mol/LAld作用48 h组的PI明显高于24 h组(P 0.01),10~(-7mol/LAld作用72 h组的PI明显高于48 h组(P 0.01)。 4. Ald和Spi对CFs胶原合成的影响:羟脯氨酸的量能反映胶原代谢情况。羟脯氨酸含量测定表明:与对照组比较,相应时间点的10~(-7) mol/L Ald组的平均吸光度值均显著升高(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald刺激组比较,相应时间点的10~(-7) mol /L Ald+ 10~(-6) mol/L Spi组的平均吸光度值均显著降低(P 0.01,P 0.01,P 0.01)。对照组与相应时间点的10~(-7) mol/L Ald+10~(-6) mol/L Spi组比较均有显著差异(P 0.01,P 0.01,P 0.01),即10~(-6) mol/L Spi不能完全逆转10~(-7) mol /L Ald的促胶原合成作用。10~(-7) mol/L Ald 48 h组与10~(-7mol/L Ald 24 h组比较,10~(-7) mol/L Ald 72 h组与10~(-7) mol/L Ald 48 h组比较,平均吸光度值均显著升高(P 0.01, P 0.01),即随时间延长,Ald刺激的胶原合成显著增加。 5. Ald对CFs周期蛋白Cycin D1表达的影响:免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描检测蛋白表达结果表明,与对照组比较,10~(-7mol /L Ald刺激CFs 24 h、48 h均可明显上调CFs胞核内的Cycin D1表达(P 0.01,P 0.05),且Ald作用24 h时Cycin D1表达上调较48 h更为显著(P 0.01)。 6. Ald对CFs周期蛋白Cyclin E2表达的影响:免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描检测蛋白表达结果表明,与对照组比较,10~(-7mol /L Ald刺激CFs 24 h、48 h、72 h均可明显上调CFs胞核内的Cycin E2表达(P 0.01,P 0.05,P 0.05),且Ald作用24 h时Cycin E2表达上调较48 h、72 h更为显著(P 0.01,P 0.01)。 7. Ald对CFs周期蛋白P-ERK1/2表达的影响:免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描检测蛋白表达结果表明,与对照组比较,10~(-7mol /L Ald刺激CFs 5 min、15 min、30 min、45min、60 min、2 h、4 h、8 h、24 h均可明显上调P-ERK1/2表达(P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.01,P 0.05),且在Ald刺激30 min和4 h时P-ERK1/2表达量2次达峰。 8. Ald对CFs周期蛋白p-AKT表达的影响:免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描检测蛋白表达结果表明,与对照组比较,10~(-7mol /L Ald刺激CFs 45 min、60 min、2 h均可明显上调P-AKT表达(P 0.01,P 0.01,P 0.01),但无明显峰值。(见Fig. 1-6) 结论:外源性Ald可诱导CFs增殖、DNA合成和胶原合成,发挥其致心肌纤维化作用,此作用与其通过ERK1/2和Akt通路上调周期蛋白Cycin D1和Cyclin E2表达有关。 第二部分阿托伐他汀对醛固酮诱导的SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的抑制作用及其机制探讨 目的:研究Ato对Ald诱导的SD乳鼠CFs增殖和胶原合成的抑制作用及其作用的分子机制。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,以Ald诱导其增殖和胶原合成,并加入Ato干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,流式细胞术检测CFs周期,羟脯氨酸试剂盒检测CFs胶原合成,免疫荧光染色,激光共聚焦显微镜扫描和Western Blot半定量p-ERK1/2、p-AKT、Cyclin D1、Cyclin E2的表达变化。 结果:1. Ato对Ald诱导的CFs增殖的影响:与对照组比较, 10~(-7 mol/L Ald组的平均吸光度值显著升高( P 0.01),10~(-7) mol/L Ald+10~(-6 mol/L Spi、10~(-8) mol/L、10~(-7) mol/L Ato组无显著差异。10~(-7) mol/L Ald +10~(-6) mol/L、10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著低于对照组(P 0.01,P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,同时给予10~(-6) mol/L Spi、10~(-8) mol/L~10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01)。 2. Ato对Ald诱导的CFs DNA合成的影响:与对照组比较,10~(-7 mol/L Ald组的平均吸光度值显著升高(P 0.01),10~(-7) mol/L Ald+10~(-6mol/L Spi、10~(-8) mol/L、10~(-7) mol/L Ato组无显著差异。10~(-7) mol/L Ald +10~(-6) mol/L、10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著低于对照组(P 0.01,P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,同时给予10~(-6) mol/L Spi、10~(-8) mol/L~10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01)。 3. Ato对Ald诱导的CFs细胞周期的影响:1)对各组各时间段的G1期细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h均能明显降低G1期细胞百分比(均P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato、10~(-6 mol/L Spi+10~(-7) mol/L Ald 24 h、48 h、72 h,G1期细胞均明显增多(均P 0.01)。 2)对各组各时间段的S期细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h均能明显增加S期细胞百分比(均P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato、10~(-6) mol/L Spi+10~(-7) mol/L Ald 24 h、48 h、72 h,S期细胞均明显较少(均P 0.01)。 3)对各组各时间段的PI进行统计学分析,结果表明:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h均能明显增加PI(均P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato、10~(-6) mol/L Spi +10~(-7) mol/L Ald 24 h、48 h、72 h, PI均明显降低(均P 0.01)。 4. Ato和Ald对CFs凋亡的影响:流式细胞术检测亚二倍体峰,结果显示,与对照组比较,10~(-6、10~(-5) mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 24 h、48 h、72 h组凋亡细胞比例显著增加(均P 0.01)。10~(-6、10~(-5mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 48 h组凋亡细胞比例分别较对应的10~(-6、10~(-5) mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 24 h组显著增加(P 0.01,P 0.01),10~(-6、10~(-5 mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 72 h组凋亡细胞比例分别较对应的10~(-6、10~(-5 mol/L Ato+10~(-7) mol/L Ald 48 h组显著增加(P 0.01,P 0.01)。 5. Ato对Ald诱导的CFs胶原合成的影响:对各组各时间段培养基中的羟脯氨酸含量进行测定,结果表明:与对照组比较,10~(-7) mol/L Ald作用24 h、48 h、72 h,平均吸光度值均显著升高(均P 0.01)。与10~(-7) mol/L Ald组比较,同时给予10~(-6) mol/L Spi、10~(-8~10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01)。 6. Ato对Ald诱导的CFs周期蛋白Cyclin D1表达的影响:10~(-5 mol/L Ato可明显抑制10~(-7) mol/L Ald上调的Cyclin D1的表达(P 0.01)。 7. Ato对Ald诱导的CFs周期蛋白Cyclin E2表达的影响:10~(-5 mol/L Ato可明显抑制10~(-7) mol/L Ald上调的Cyclin E2的表达(P 0.01)。 8. Ato对Ald诱导的CFs p-ERK1/2表达的影响:1)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 30 min同时给予10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato进行干预,免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描结果表明,各浓度Ato均不能抑制P-ERK1/2表达。 2)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 4 h同时给予10~(-7)~10~(-5mol/L Ato进行干预,免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描结果表明,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato均能抑制P-ERK1/2表达(均P 0.01)。10~(-6) mol/L较10~(-7) mol/L Ato对P-ERK1/2表达的抑制作用更强(P 0.01)。 3)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 4 h同时给予不同浓度Ato进行干预,Western结果表明,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato均能抑制P-ERK1/2表达(均P 0.01)。 9. Ato对Ald诱导的CFs P-AKT表达的的影响:1)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 1 h同时给予不同浓度Ato进行干预,免疫荧光染色,共聚焦显微镜扫描结果表明,10~(-7 ~10~(-5) mol/L Ato均能抑制P-AKT表达(均P 0.01)。10~(-6) mol/L与10~(-7) mol/L Ato比较,10~(-5) mol/L与10~(-6) mol/L Ato比较,对P-AKT表达的抑制作用均有显著差异(P 0.01,P 0.01)。 2)10~(-7) mol/L Ald刺激CFs 1 h同时给予不同浓度Ato进行干预,Western结果表明,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato均能抑制P-AKT表达(均P 0.01)。 结论:Ato可明显抑制Ald诱导的CFs增殖、DNA合成和胶原合成,抑制Ald的致心肌纤维化作用,此作用与其通过抑制ERK1/2和Akt通路,进而抑制周期蛋白Cycin D1和Cyclin E2表达有关。 第三部分阿托伐他汀对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用和对凋亡的诱导作用 目的:研究Ato对SD乳鼠CFs增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,并加入Ato干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,倒置生物显微镜和荧光显微镜检测凋亡细胞形态,流式细胞术检测CFs凋亡率。 结果:1. Ato对CFs增殖的影响:与对照组比较,10~(-7) mol/L~10~(-5 mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01),10~(-5) mol/L FPP +10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值显著降低(P 0.01),即10~(-5) mol/L FPP不能完全拮抗10~(-5) mol/L Ato对CFs增殖的抑制作用。与Ato单独作用组比较,同时给予10~(-5mol/L FPP,10~(-7) mol/L~10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著升高(均P 0.01)。 2. Ato对CFs DNA合成的影响:与对照组比较,10~(-7) mol/L~10~(-5 mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01),10~(-5) mol/L FPP +10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著降低(P 0.01),即10~(-5) mol/L FPP不能完全拮抗10~(-5) mol/L Ato对CFs DNA合成的抑制作用。与Ato单独作用组比较,同时给予10~(-5) mol/L FPP,10~(-7) mol/L~10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著升高(均P 0.01)。 3. Ato对CFs的形态学影响:1)倒置生物显微镜观察不同浓度Ato对CFs的影响,可见未加Ato处理组的CFs细胞间隙小且贴壁良好,几乎没有脱壁漂浮的圆形死细胞。Ato处理后,部分细胞胞质回缩,细胞间间隙增大,细胞贴壁能力不同程度减弱,随Ato浓度增大,处理时间延长,细胞形态改变越来越明显。 2)采用瑞氏—吉姆萨染色法,对空白组和各处理组细胞进行染色后,倒置生物显微镜下观察,可见未加Ato处理组的CFs呈梭形、三角形、多边形,胞浆着色均匀,淡粉红色,胞核较大呈深粉色或淡紫色,细胞贴壁良好,细胞间隙很小。Ato处理后,CFs出现了不同程度的胞质回缩、变形,核固缩、深染,细胞间隙增大等一系列改变。随Ato浓度增大,处理时间延长,细胞的变化越发显著。 3)Hochest33258染色后,荧光显微镜下进行观察,可见未加Ato处理组的CFs胞核形状规则,呈椭圆形,着色较浅,呈淡蓝色荧光。Ato处理后,胞核出现不同程度固缩、变形、甚至崩解为大小不一的碎片,着色较深,呈深蓝色。 4. AnexinV/PI双染,流式细胞术检测Ato对CFs凋亡的影响:1)对不同浓度Ato处理组各时间段早期凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato作用24 h、48 h、72 h均能明显增加早期凋亡细胞百分比(均P 0.01)。对相同浓度Ato作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ato作用后的早期凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示除10~(-7) mol/L与10~(-6) mol/L Ato间作用24 h和72 h无显著差异外,Ato可时间、剂量依赖性的增加早期凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 2)对不同浓度Ato处理组各时间段晚期凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato作用24 h、48 h、72 h均能明显增加晚期凋亡细胞百分比(均P 0.01)。对相同浓度Ato作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ato作用后的晚期凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示除10~(-7) mol/L Ato作用24 h和48 h之间、10~(-6) mol/L Ato作用24 h和48 h之间无显著差异外, Ato可时间、剂量依赖性的增加晚期凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 3)对不同浓度Ato处理组各时间段总凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato作用24 h、48 h、72 h均能明显增加总凋亡细胞百分比(均P 0.01)。对相同浓度Ato作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ato作用后的凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示Ato可时间、剂量依赖性的增加凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 5. PI单染,流式细胞术检测亚二倍体峰:与相应对照组比较,10~(-7)~10~(-5) mol/L Ato作用24 h、48 h、72 h均能明显增加凋亡细胞百分比(均P 0.01)。与10~(-5) mol/L Ato单独作用组比较,同时给予10~(-5 mol/L FPP在24 h、48 h和72 h均能部分逆转Ato对CFs的凋亡诱导作用(均P 0.01)。 结论:10~(-7)~10~(-5mol/L Ato不仅可抑制CFs增殖和DNA合成,还可时间和剂量依赖性的诱导CFs凋亡。 第四部分瑞舒伐他汀对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用和对凋亡的诱导作用 目的:研究Ros对SD乳鼠CFs增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,并加入Ros干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,倒置生物显微镜和荧光显微镜检测凋亡细胞形态,流式细胞术检测CFs凋亡率。 结果:1. Ros对CFs增殖的影响:与对照组比较,10~(-8) mol/L~10~(-5 mol/L Ros组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01),10~(-5) mol/L FPP +10~(-5) mol/L Ros组的平均吸光度值显著降低(P 0.01),即10~(-5) mol/L FPP不能完全拮抗10~(-5) mol/L Ros对CFs增殖的抑制作用。与Ros单独作用组比较,同时给予10~(-5) mol/L FPP,10~(-8) mol/L~10~(-5) mol/L Ato组的平均吸光度值均显著升高(P 0.05,P 0.01,P 0.01, P 0.01)。 2. Ros对CFs DNA合成的影响:与对照组比较,10~(-7) mol/L~10~(-5 mol/L Ros组的平均吸光度值均显著降低(均P 0.01),10~(-5) mol/L FPP +10~(-5) mol/L Ros组的平均吸光度值显著降低(P 0.01),即10~(-5) mol/L FPP不能完全拮抗10~(-5) mol/L Ros对CFs DNA合成的抑制作用。与Ros单独作用组比较,同时给予10~(-5) mol/L FPP, 10~(-7) mol/L~10~(-5) mol/L Ros组的平均吸光度值均显著升高(均P 0.01)。 3. Ros对CFs的形态学影响:1)倒置生物显微镜观察不同浓度Ros对CFs的影响,可见未加Ros处理组的CFs细胞间隙小且贴壁良好,几乎没有脱壁漂浮的圆形死细胞。Ros处理后,部分细胞胞质回缩,细胞间间隙增大,细胞贴壁能力不同程度减弱,随Ros浓度增大,处理时间延长,细胞形态改变越来越明显。 2)采用瑞氏—吉姆萨染色法,对空白组和各处理组细胞进行染色后,倒置生物显微镜下观察,可见未加Ros处理组的CFs呈梭形、三角形、多边形,胞浆着色均匀,淡粉红色,胞核较大呈深粉色或淡紫色,细胞贴壁良好,细胞间隙很小。Ros处理后,CFs出现了不同程度的胞质回缩、变形,核固缩、深染,细胞间隙增大等一系列改变。随Ros浓度增大,处理时间延长,细胞的变化越发显著。 3)Hochest33258染色后,荧光显微镜下进行观察,可见未加Ros处理组的CFs胞核形状规则,呈椭圆形,着色较浅,呈淡蓝色荧光。Ros处理后,胞核出现不同程度固缩、变形、甚至崩解为大小不一的碎片,着色较深,呈深蓝色。 4. AnexinV/PI双染,流式细胞术检测Ros对CFs凋亡的影响:1)对不同浓度Ros处理组各时间段早期凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,除10~(-7) mol/L Ros作用24 h外,10~(-7) mol/L Ros作用48 h、72 h ,10~(-6、10~(-5) mol/L Ros作用24 h、48 h、72 h均能明显增加早期凋亡细胞百分比(均P 0.05)。对相同浓度Ros作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ros作用后的早期凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示Ros可时间、剂量依赖性的增加早期凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 2)对不同浓度Ros处理组各时间段晚期凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,除10~(-7) mol/L Ros作用24 h外,10~(-7) mol/L Ros作用48 h、72 h ,10~(-6、10~(-5) mol/L Ros作用24 h、48 h、72 h均能明显增加晚期凋亡细胞百分比(均P 0.05)。对相同浓度Ros作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ros作用后的晚期凋亡细胞百分比分别进行比较,Ros可时间、剂量依赖性的增加晚期凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 3)对不同浓度Ros处理组各时间段总凋亡细胞百分比,进行统计学分析,结果表明:与相应对照组比较,10~(-7~10~(-5) mol/L Ros作用24 h、48 h、72 h均能明显增加总凋亡细胞百分比(均P 0.05)。对相同浓度Ros作用不同时间,和相同时间点不同浓度Ros作用后的凋亡细胞百分比分别进行比较,结果显示Ros可时间、剂量依赖性的增加凋亡CFs的百分比(均P 0.05)。 5. PI单染,流式细胞术检测亚二倍体峰:与相应对照组比较,10~(-7~10~(-5) mol/L Ros作用24 h、48 h、72h均能明显增加凋亡细胞百分比(均P 0.01)。与10~(-5) mol/L Ato单独作用组比较,同时给予10~(-5 mol/L FPP在24 h、48 h和72 h均能部分逆转Ros对CFs的凋亡诱导作用(均P 0.01)。 结论:10~(-7~10~(-5mol/L Ros不仅可抑制CFs增殖和DNA合成,还可以时间和剂量依赖性的诱导CFs凋亡。 第五部分阿托伐他汀和瑞舒伐他汀对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖抑制作用比较 目的:比较Ato和Ros对SD乳鼠CFs增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用。 方法:用胰酶消化法分离并培养新生SD大鼠的CFs,并加入Ato或Ros干预,采用MTT法检测CFs的增殖,Brdu法检测CFs的DNA合成,流式细胞术检测CFs细胞周期,羟脯氨酸试剂盒检测CFs胶原合成,流式细胞术检测CFs凋亡。 结果:1. CFs增殖测定:对MTT测定结果进行统计分析显示,与空白对照组相比,Ros和Ato 10~(-7~10~(-5) mol/L均可抑制新生大鼠CFs增殖(均P 0.01)。Ros与Ato各相同剂量组相比,对CFs增殖的抑制效果无显著差异。 2. CFs DNA合成测定:对Brdu测定结果进行统计分析显示,与空白对照组相比,Ros和Ato 10~(-7~10~(-5) mol/L组均可抑制新生大鼠CFs DNA合成(均P 0.01)。Ros与Ato各相同剂量组相比,对CFs DNA合成的抑制效果无显著差异。 3. CFs细胞周期测定:流式细胞术检测细胞周期,结果显示,与空白对照组比较,Ros和Ato 10~(-7~10~(-5) mol/L组作用24 h均可增加CFs处于G0/G1期的百分率,降低CFs处于S期的百分率,并降低细胞增殖指数(PI)(均P 0.05)。Ros和Ato各相同剂量组间,处于G0/G1期、G2/M期和S期的CFs比例及PI均无显著差异,即2药对细胞周期的阻滞作用相似。 4.流式细胞术检测亚二倍体峰:流式细胞术检测亚二倍体峰,可反应每个处理组中晚期凋亡细胞所占比率,结果显示,10~(-7~10~(-5mol/L Ato和Ros均可诱导CFs凋亡(均P 0.01),且2药均有明显的剂量依赖,随药物浓度增加,凋亡细胞比率随之增加(均P 0.01)。Ros与Ato各相同剂量组相比,对CFs凋亡的促进效果无显著差异。 5. CFs胶原分泌测定:羟脯氨酸测定结果显示,Ros和Ato 10~(-7~10~(-5) mol/L组均可抑制新生大鼠CFs胶原分泌(均P 0.01)。Ros对CFs胶原分泌的抑制作用呈明显的剂量依赖,随Ros浓度增加,作用逐渐增强(均P 0.01)。10~(-7与10~(-6) mol/L Ato间对胶原分泌的抑制作用无显著差异,10~(-6与10~(-5) mol/L Ato间在各时间点对胶原分泌的抑制作用差异显著(均P 0.01)。Ros与Ato各相同剂量组相比,对CFs胶原合成的抑制效果无显著差异。 结论:Ros与Ato对SD乳鼠CFs增殖和DNA合成及胶原合成的抑制作用无明显差异。Ros与Ato对乳鼠CFs凋亡的诱导作用无明显差异。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R541.6

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 徐岩;徐予;;瑞舒伐他汀与阿托伐他汀对老年冠心病患者降脂疗效的对比观察[J];医药论坛杂志;2009年06期
2 张冀东;崔炜;王永利;张海林;武宇洲;鲁静朝;杨晓红;;阿托伐他汀抑制大鼠心肌成纤维细胞钙调神经磷酸酶的表达[J];基础医学与临床;2007年11期
3 冯惠平,崔炜,都军,郝玉明;洛伐他汀对醛固酮诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响[J];中国新药与临床杂志;2005年01期
4 韩辉;薛静;张静瑜;徐芳辉;王宇虹;;瑞舒伐他汀与阿托伐他汀治疗老年高胆固醇血症的疗效和安全性比较[J];中国新药与临床杂志;2008年02期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 沈冲;王永亮;吕妍坤;邵雪莲;丁晓松;吴永全;;普伐他汀对慢性心力衰竭患者心肌纤维化的影响[J];中国医药导刊;2010年02期
2 李金萍;谢大兴;冯永东;李晓兰;陶德定;龚建平;;细胞周期特异性细胞凋亡的形态学观察[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2005年05期
3 黄俊琪;TRAIL及其受体系统、细胞凋亡与病毒感染[J];国外医学.病毒学分册;2002年05期
4 郭延锋;高均伟;朱国坡;刘兴友;;细胞凋亡常用检测方法的研究进展[J];中国畜牧兽医;2010年02期
5 席艳;赵小磊;史本彩;齐义军;;肿瘤细胞凋亡与宫颈癌演进的关系[J];肿瘤基础与临床;2009年04期
6 李德忠,卢绮萍;肝缺血再灌注不同时限细胞凋亡和增殖变化的动态研究[J];华南国防医学杂志;2005年02期
7 吴有志;徐善水;;细胞凋亡及其基因调控与脑血管痉挛[J];神经疾病与精神卫生;2006年01期
8 张冀东;崔炜;王永利;张海林;武宇洲;鲁静朝;杨晓红;;阿托伐他汀抑制大鼠心肌成纤维细胞钙调神经磷酸酶的表达[J];基础医学与临床;2007年11期
9 刘迎雪;李虎;张松涛;樊昱;韩菊仙;周静;;瑞舒伐他汀治疗高龄老年人高脂血症的疗效及安全性观察[J];中华保健医学杂志;2010年05期
10 杨晓红;崔炜;王雅依;鲁静朝;张冀东;刘德敏;刘凡;谢瑞芹;谷国强;都军;;阿托伐他汀对2型糖尿病大鼠心肌NF-κB、TNF-α表达的影响[J];解放军医学杂志;2008年03期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘佳;他汀类药物的肾保护研究[D];南京医科大学;2010年
2 赵景霞;纳米氧化锌对海马神经元电生理特性的影响及对PC12细胞生物学效应的机制研究[D];南开大学;2010年
3 于蕾;野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的研究[D];北京中医药大学;2010年
4 韦燕飞;白花丹醌对人肝星状细胞作用的分子机制研究[D];广西医科大学;2011年
5 佟敬山;ER-α 36在子宫内膜癌中的功能及Icaritin诱导的细胞凋亡的研究[D];吉林大学;2011年
6 陈治中;人T细胞免疫球蛋白黏蛋白与凋亡细胞的相互作用研究[D];华中科技大学;2011年
7 吴松一;纳米酞菁光敏剂光动力治疗脉络膜新生血管的实验研究[D];福建医科大学;2011年
8 金晶;Pin1在人恶性黑色素瘤发生发展中作用研究 Pin1抑制剂的筛选及机制研究 XLN306的抗肿瘤作用及机制研究[D];北京协和医学院;2010年
9 高丹;微流控芯片平台上细胞捕获及药物作用分析方法研究[D];北京化工大学;2011年
10 陈琳;Caspase-3在鸡肉成熟过程中的作用以及与calpain的交互关系研究[D];南京农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郭延锋;CSISV人工感染SPF雏鸡和商品肉仔鸡后免疫器官的细胞凋亡[D];河南科技学院;2010年
2 樊惠;HBOA及其衍生物的合成及保肝作用的研究[D];广西医科大学;2011年
3 王丽娟;国产瑞舒伐他汀与阿托伐他汀对血脂及炎症因子影响的临床研究[D];山西医科大学;2011年
4 刘文跃;小儿急性肠梗阻肠粘膜免疫屏障损伤及细菌移位的研究[D];山西医科大学;2011年
5 王小亮;华蟾毒精的抗肿瘤作用及对Th1/Th2细胞分泌细胞因子的影响[D];吉林大学;2011年
6 张晓旭;大田软海绵酸(Okadaic Acid,OA)对小鼠胚胎细胞3T3的影响[D];曲阜师范大学;2011年
7 李勇;不同放射活度~(125)I粒子对人中分化胃癌细胞株(AGS)敏感性的体外实验研究[D];昆明医学院;2011年
8 张小年;钌配合物抗肿瘤活性及其诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制[D];暨南大学;2011年
9 赵涛;8周有氧及间歇运动对心梗大鼠心肌梗死面积、血流动力学及心肌Bax、Bcl-2和Caspase-3表达的作用研究[D];陕西师范大学;2011年
10 张元隆;Caspase 3和Caspase 8与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的关系[D];福建医科大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 冯惠平,崔炜,单保恩,郝京生,都军,郝玉明;醛固酮降低新生大鼠心肌成纤维细胞iNOS表达和NO含量[J];基础医学与临床;2005年02期
2 李东宝,沈潞华;羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂对细胞增殖和凋亡的影响[J];中国新药与临床杂志;2000年05期
3 冯惠平,崔炜,都军,郝玉明;洛伐他汀对醛固酮诱导大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响[J];中国新药与临床杂志;2005年01期
4 温隽珉;董少红;李宜富;罗林杰;陈科奇;;阿托伐他汀40mg在急性冠脉综合征介入术后的应用[J];中国新药与临床杂志;2007年05期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 苗迎秋;向冬喜;郑丛龙;;纳米银抗流感病毒H3N2作用的实验研究[J];山东医药;2010年16期
2 王改华;刘贵鹏;;孕激素对子宫内膜癌Ishikawa细胞TGF-β1、TβR1表达的影响[J];中国医科大学学报;2011年04期
3 王海燕;郭良淼;陈勇;赵雪花;成彩莲;吴勉云;何丽娅;;槲皮素抑制人胃癌MGC-803细胞增殖并诱导其凋亡的研究[J];细胞与分子免疫学杂志;2006年05期
4 季建美;胡文静;禹立霞;钱晓萍;刘宝瑞;;叶下珠醇提物对人胃癌细胞MKN28的抑制作用[J];南京中医药大学学报;2010年01期
5 辛春雷;张彬;李光耀;陈双峰;王景霞;杨孟祥;王春波;杨纯正;肖太武;刘耕陶;;海生素对体外白血病K562细胞的抑制作用及其机制[J];山东医药;2007年17期
6 庄永志,王俊杰!100083,张占春!100083,贾廷珍!100083;γ射线对大鼠血管平滑肌细胞抑制作用的机理[J];中华放射医学与防护杂志;2001年04期
7 王秀丽,韩淑华,黄瑾;哮喘病人抑制性T淋巴细胞作用的研究[J];免疫学杂志;2002年01期
8 黎檀实,沈洪,尹明,吴旭辉,宋扬丽,何权瀛;生长激素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡抑制作用的观察[J];中国危重病急救医学;2002年05期
9 张国锋,王元和,张明敖,王强,罗芸葆,韩策然;SU5416对结肠癌生长和转移抑制作用的实验研究[J];中华胃肠外科杂志;2001年03期
10 许华,刘善荣,邓小明,徐美英,刘树孝;丙泊酚对脑缺血大鼠海马区细胞凋亡的影响[J];第二军医大学学报;2000年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 沈建国;王林波;;肝细胞生长因子基因转染对胃癌MKN-45细胞凋亡抑制作用的研究[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
2 刘鑫;杜彦艳;单保恩;;北豆根总碱诱导Hela细胞凋亡及其机制研究[A];第五届全国中医药免疫学术研讨会——暨环境·免疫与肿瘤防治综合交叉会议论文汇编[C];2009年
3 李建华;黄建荣;卢佳怡;樊雪萍;许继德;;胰岛素样生长因子-I对白介素-1诱导软骨细胞凋亡的抑制作用[A];中国生理学会第21届全国代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2002年
4 杜晓梅;高国兰;;三氧化二砷在妇科恶性肿瘤的研究进展[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年
5 吴新宇;李娟;王宏芳;李静;徐坤;侯雷;孙志伟;;新型5-氟尿嘧啶衍生物TBF抗肿瘤活性及其作用机制[A];中国毒理学会第四届全国学术会议论文(摘要)集[C];2005年
6 杜晓梅;高国兰;;三氧化二砷在妇科恶性肿瘤的研究进展[A];全国子宫颈癌暨湖北省妇科肿瘤专业委员会第五次妇科肿瘤学术会议论文汇编[C];2006年
7 张玉涛;孙荣国;马明;王定勇;;硝酸根对水体汞还原的抑制作用及其机理研究[A];第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C];2011年
8 施巍炜;杨胜于;黄有国;;G_(βγ)对rG_(sα)与AC偶联活性的抑制作用[A];第七届全国生物膜学术讨论会论文摘要汇编[C];1999年
9 季宇彬;娄艳华;高世勇;;海洋多糖抗肿瘤作用机制研究进展[A];药学发展前沿论坛及药理学博士论坛论文集[C];2008年
10 蔡久英;张博;;红景天苷对乳鼠心肌细胞凋亡的影响[A];第八次全国中西医结合心血管病学术会议论文集[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 孙金花;替卡格雷:血小板抑制作用更强更安全[N];中国医药报;2011年
2 格林期货 李冬梅;短暂喘息之后 油价继续狂奔[N];中国证券报;2006年
3 ;俄专家认为抗氧化剂对癫痫有抑制作用[N];中国高新技术产业导报;2001年
4 乔健;“凡乐”对冠状病毒具有一定抑制作用[N];医药经济报;2003年
5 华文;俄专家认为抗氧化剂对癫痫有抑制作用[N];中国医药报;2001年
6 胡进之;美加息周期近尾声游资再度布局中国[N];第一财经日报;2006年
7 伏新顺;调味佳品多良药[N];家庭医生报;2007年
8 郭茹;人民币“加速”跑:只因美元在贬值[N];第一财经日报;2008年
9 本报记者 李雁争;业界:成品油提价对经济抑制作用有限[N];上海证券报;2009年
10 牛娟娟;“SD凹印对印技术”获国家技术发明一等奖[N];金融时报;2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王倩;他汀类药物对SD乳鼠心肌成纤维细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用及其信号转导通路研究[D];河北医科大学;2010年
2 全香花;麒麟菜天然海藻色素糖蛋白的制备及其对H_(22)肝癌的抑制作用研究[D];青岛大学;2013年
3 罗开忠;人IGFBP-3cDNA的克隆、表达及对肝癌细胞的抑制作用[D];中南大学;2004年
4 吕天敬;重组人干扰素-ω在体内外对肿瘤细胞影响的实验研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
5 张霞;希夫碱配合物的合成、表征及抗肿瘤活性研究[D];中国海洋大学;2009年
6 杨宗辉;天南星有效部位抗肝癌作用及其机制的研究[D];吉林大学;2007年
7 罗健华;TIMP-1过表达对肾脏缺血/再灌注损伤诱导肾小管上皮细胞凋亡的影响及机制研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
8 磨美兰;PRRSV感染对猪肺泡巨噬细胞外源性抗原加工递呈功能的影响[D];中国农业大学;2005年
9 朱丽君;用核苷酸干扰技术抑制纤维母细胞生长因子第三型受体在多发性骨髓瘤中的表达及受体功能研究[D];浙江大学;2005年
10 黄立军;α_1抗胰蛋白酶在肺癌发生发展中的作用[D];第四军医大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 单小松;蜈蚣提取物对胶质瘤细胞的体外抑制作用实验研究[D];河北医科大学;2005年
2 王小华;TNP-470联合CTX对小鼠LA795肺腺癌生长和转移抑制作用[D];南华大学;2005年
3 黄丹虹;天然产物D5、S3及其衍生物抗肿瘤活性的初步研究[D];厦门大学;2008年
4 李天舒;冲绳波布蛇毒提取蛋白-1对大鼠皮下胶质瘤的抑制作用[D];吉林大学;2007年
5 王晓辉;FTY720对胰腺癌抑制作用的体内实验研究[D];浙江大学;2008年
6 赖红琳;聚多曲霉菌提取液对培养人肺鳞癌细胞增殖作用的实验研究[D];第二军医大学;2005年
7 常亮;行气活血汤对动脉损伤兔的血管平滑肌细胞增殖和凋亡的研究[D];辽宁中医药大学;2007年
8 雷三喜;秋水仙碱对小鼠胶质瘤母细胞抑制作用的体外实验研究和对运动功能的影响[D];昆明医学院;2008年
9 曾霞波;姜黄素对人乳腺癌细胞的抑制作用及其光照增强效果的观察[D];重庆医科大学;2008年
10 李娜;姜黄素衍生物FM04抗肿瘤作用及其机制[D];福建医科大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026