吴茱萸碱对涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M增殖和凋亡的影响

【摘要】： 目的:涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma)是最常见的恶性肿瘤之一,在口腔颌面部恶性肿瘤中居第二位。浸润性极强和易发生远处转移是腺样囊性癌的重要特征。即使手术切除后也常有局部复发和远处转移,其远处转移率在口腔颌面部居首位。涎腺腺样囊性癌的发病及转移机制目前尚不清楚。因此有必要探索新的治疗方法,以期提高对腺样囊性癌的疗效,减少局部复发和远处转移的发生,改善患者的生存质量。中药吴茱萸为芸香科植物吴茱萸干燥近成熟果实,吴茱萸碱(evodiamine)为其主要活性物质。吴茱萸有温中散寒,疏肝止痛之功效,常用于脘腹冷痛,呕吐腹泻,头痛胃痛和痛经等。近代医学亦证明吴茱萸有镇痛,安神,抗菌,降压,抗肿瘤等药理作用。但是吴茱萸碱否能诱导涎腺腺样囊性癌细胞的调亡或坏死,国内外尚未见报道。本研究拟对体外培养的人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞经不同浓度、不同时间吴茱萸碱作用后,采用流式细胞术等检测细胞凋亡情况,观察不同浓度、不同作用时间下吴茱萸碱对ACC-M细胞系是否有诱导凋亡作用,探讨其可能的机制。并为临床上采用吴茱萸碱治疗涎腺腺样囊性癌提供理论依据。 方法: 1材料 ACC-M:上海交通大学口腔颌面外科实验室提供,建立于1995年;吴茱萸碱:中国药品生物制品检定所提供。 2方法(1)药液配制 吴茱萸碱用DMSO溶解配制成20mg/ml储存液,使用前用培养液稀释(DMSO浓度低于0.001%,对细胞无影响)。(2)细胞培养:采用RPMI1640培养基加入10%胎牛血清和青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml),于37℃、5%CO2恒温箱内饱和湿度培养,24～48小时传1代,以0.04%EDTA和0.25%胰蛋白酶(1:1)混合液消化传代。(3) MTT比色试验:取对数生长期细胞制成2.0×107/L细胞悬液,接种于96孔板,每孔100ul,培养24h后,加入吴茱萸碱100ul,使终浓度为0.01、0.1、1、10、100 ug/ml,设对照组和调零孔,每组5个复孔。继续培养24、48、72h后,每孔加入5g/L的MTT溶液20ul,再培养4h后吸去全部上清液,然后每孔加入200ul二甲基亚砜,振荡摇匀,使结晶充分溶解,置酶标仪上测各孔吸光度值计算生长抑制率,按作图法求出不同处理时间的IC50(生长抑制率为50%的药物浓度)。(4)倒置相差显微镜观察:将细胞接种于50ml培养瓶中,倒置显微镜观察细胞在空白培养基和含药培养基中不同培养时间的生长状况。(5)光镜观察:将细胞接种于6孔板中,孔中放置盖玻片,爬片成功后加入空白或含药培养基,培养不同时间后,瑞姬染色,光镜观察。(6)流式细胞术检测:用空白培养基和不同浓度的含药培养基处理细胞不同时间后,Annexin-V-FITC和PI双标记活细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 3统计分析 使用SPSS10.0统计学软件,应用SNK-q检验、相关分析以及χ2检验对吸光度值、生长抑制率和凋亡率进行统计学分析结果:1 MTT比色试验:吴茱萸碱(1ug/ml以上)对ACC-M细胞具有明显的生长抑制作用,药物作用24h、48h、72h后的IC50分别为6.5ug/ml、4.5ug/ml和0.85ug/ml;最大生长抑制率可达89%。经统计学分析,各时间组不同浓度之间吸光度值明显不同(P0.05),各浓度用药组不同处理时间之间生长抑制率不同(P0.01),药效与药物浓度和作用时间具有明显的正相关性。 2倒置显微镜观察:对照组的细胞贴壁生长,呈扁平多角形,胞质饱满,靠近中央处有圆形的细胞核,细胞生长迅速,呈“铺路石”状生长;用药组的细胞生长明显减慢,并且可见有细胞脱落,贴壁的细胞变圆,而且皱缩变小,连接松解,核颜色加深,细胞的折光性增强。 3光镜观察:对照组的细胞核浆比大,并且多个核仁;而用药组胞质浓缩,且核浆比例降低,核仁减少甚至消失,出现染色质沿核膜内侧排列的现象,并且可见细胞核碎裂现象。 4流式细胞术检测:对照组细胞也有凋亡,但是凋亡率低;用药组细胞凋亡明显,且凋亡率随药物浓度增大与处理时间延长而上升,药物浓度达1ug/ml时凋亡率明显上升,经统计学分析,各时间组和各浓度组之间有统计学差异(p0.01)。 结论:吴茱萸碱具有抑制涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M增殖和诱导其凋亡的作用,并且呈浓度和时间依赖性。