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《河北医科大学》 2010年
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ERK表达及活化在食管癌进展过程中的作用机制研究

赵萌  
【摘要】: 食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一, 1999年WHO资料中显示,中国食管癌患者占世界总数的46.6%, 90%的食管癌为鳞癌,腺癌约占5% ~10%。每年因食管癌而死亡的人数已列居恶性肿瘤的第四位。尽管目前食管癌的癌前病变病理诊断技术己有很大的提高,新的预防措施和更有效的联合治疗方法的改进,仍阻挡不了食管癌发病率的上升。因此,进一步研究临床抗肿瘤药物作用靶点及食管癌变过程中相关信号转导途径的活化,仍为食管癌的治疗研究的目标。 细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases , ERKs)为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的一个亚族,广泛存在于各种生物体中,在细胞癌变过程中具有重要作用。其可被多种丝裂原信号和癌基因产物激活成磷酸化状态(P-ERK),转导信号至细胞核内,参与调节细胞增殖、分化、凋亡等多种生理过程,并在细胞的恶性转化中起重要作用。 羟基喜树碱(HCPT)是近年从我国珙桐科植物喜树中提取的抗癌生物碱——喜树碱的衍生物,是我国临床一线的化疗药物,广泛用于胃肠道恶性肿瘤、肝癌、白血病、膀胱癌、肺癌等恶性肿瘤的化疗。但其抗癌作用机制目前尚不十分清楚。近年研究发现,羟基喜树碱能阻止肿瘤细胞从S期进人G2/M期,并可诱发其细胞凋亡。 本课题通过研究ERK表达及其活化(P-ERK)与食管鳞状细胞癌(ESCC)临床病理特征关系,HCPT对食管癌细胞株Eca109和P-ERK的相关性影响,探讨ERK在食管癌发生发展中的意义,为食管癌的综合性防治研究提供实验依据。 第一部分ERK在食管癌组织中的表达及其意义 目的:研究食管鳞状细胞癌组织及黏膜组织中的细胞外信号调节激酶(ERK)的表达及磷酸化水平,探讨ERK在ESCC发生发展中的作用及其意义。 方法:收集60例新鲜食管癌组织和25例粘膜组织,食管癌组织经临床病理确诊为鳞状细胞癌。采用RT-PCR法及Western blot法分别检测食管癌组织与粘膜组织ERK转录水平和翻译水平的表达情况及ERK活性水平的高低,并与食管癌临床病理特征进行相关性讨论分析。 结果: 1. RT-PCR结果显示:食管癌组织中ERK基因的条带密度和宽度明显高于粘膜组织。可见ERK mRNA基因表达在食管癌组织中明显增高,而在粘膜组织中呈现低表达。食管癌组织ERK mRNA的相对表达量为(0.656±0.070),粘膜组织为( 0.450±0.055 )。差异有统计学意义(P0.01)。 2.由Western blotting结果可以看出,ERK及其活化状态(P-ERK)在食管癌组织中表达明显增强,而在食管粘膜组织中则呈低表达。食管粘膜组织及癌组织中ERK及P-ERK的相对表达量分别为(0.581±0.053 vs 0.702±0.703;0.542±0.053 vs 0.659±0.072)。差异均有统计学意义(P0.01)。 3. ERK的表达与临床病理特征的关系 RT-PCR结果显示:ERK在患者的年龄(≥60与60)、性别(男与女)和分化程度(高中分化与低分化)各组间的表达无显著性差异(P0.05),而在临床分期、淋巴结转移各组间有显著性差异(P0.05),且T3-4期患者ERKmRNA基因的表达强度显著高于T1-2期患者(0.717±0.049 vs 0.643±0.067,P0.01);食管癌淋巴结转移患者ERK mRNA基因的表达强度显著高于无淋巴结转移者(0.705±0.071 vs 0.645±0.066,P0.05)。Western blotting结果显示:T3-4期与T1-2期患者P-ERK及ERK的表达强度(0.700±0.068 vs 0.648±0.069,P0.05;0.743±0.056 vs 0.691±0.070,P0.05);有淋巴结转移患者P-ERK及ERK的表达强度与无淋巴结转移者(0.695±0.054 vs 0.648±0.072,P0.05;0.736±0.072 vs 0.690±0.066,P0.05)。与RT-PCR显示的结果相一致。 小结: 1. ERK及其磷酸化水平在ESCC组织中升高,提示ERK及其活化在ESCC发生中起着不可或缺的作用; 2. ERK的表达及其磷酸化水平与ESCC临床分期、淋巴结有无转移有一定的相关性,表明ERK的表达及其磷酸化在ESCC发展中起着重要作用; 3.尚可认为进一步研究抑制ERK通路的抗肿瘤药物,作为药物治疗ESCC的新靶点。 第二部分食管鳞癌中ERK活化作用机制的研究 目的:通过培养人食管癌Eca109细胞株,观察羟基喜树碱(HCPT)对P-ERK活性和食管癌细胞生长及凋亡的影响,进一步阐明ERK促进食管癌发展的作用机制,为临床治疗提供合理的实验依据。 方法:培养人食管癌Eca109细胞株,加入含有不同浓度的HCPT(5μm/l,10μm/l,20μm/l),采用MTT法检测食管癌细胞株增殖情况,采用流式细胞术分析食管细胞株凋亡情况,采用免疫细胞化学法检测P-ERK蛋白在人食管癌细胞中的定位及表达。 结果: 1. MTT结果显示:HCPT对食管癌Eca109细胞株有明显的抑制生长的作用。不同浓度HCPT处理的Eca109细胞株,OD值均有不同程度减小,差异有统计学意义(P0.01)。且各组细胞增殖程度随HCPT浓度的增高而降低(0.989±0.047;0.860±0.095;0.748±0.036;0.541±0.045),当药物浓度达到20μm/l时抑制细胞增殖达高峰。 2.流式细胞术结果显示:食管癌Eca109细胞经羟基喜树碱处理48小时后细胞生长明显受抑制,且随HCPT浓度的增加,凋亡率逐渐升高(0.80%;3.52%;3.91%;12.72%;P0.01)。结果与前一项实验相一致,说明HCPT促进食管癌细胞株Eca109凋亡,且抑制作用呈明显的剂量依赖性。 3.免疫细胞化学法结果显示:HCPT能显著影响食管癌细胞中P-ERK的表达,阳性细胞随着羟基喜树碱的浓度逐渐增加,其数量逐渐减少,棕黄色颗粒逐渐变小,密度逐渐减低(80.33%;57.67%;52.33%;47.67%;P0.01)。 小结: 1. HCPT抑制食管癌细胞株Eca109细胞增殖,一定浓度范围内,呈现药物剂量依赖性; 2. HCPT促进食管癌细胞株Eca109细胞凋亡; 3. P-ERK在癌细胞中的表达能够被HCPT能够有效的抑制。ERK促进ESCC进展的机制可能与细胞周期的调节相关。 结论: 1. ERK及其活化在食管鳞癌发生发展中起着不可或缺的作用,其可能与食管鳞癌预后有一定相关性,可作为研究预后的重要指标。 2.食管癌细胞增殖与ERK的活化有密切关系,抑制ERK的表达及活化能够抑制食管癌细胞的增殖。 3.羟基喜树碱的抗肿瘤机制可能与ERK下调有关。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R735.1

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【引证文献】
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9 李月考;食管癌组织中△Np73和p73在转录水平的表达状况及相关性研究[D];河北医科大学;2004年
10 孙桢;TFPI-2和SNCG在食管癌中的表达及其与食管癌浸润、转移和细胞凋亡之间的关系[D];郑州大学;2010年
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