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《河北医科大学》 2010年
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淋巴瘀滞对家兔胰肝肾组织结构和功能影响的实验研究

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【摘要】: 糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种由于胰岛素分泌绝对或相对不足,或着胰岛素作用缺陷而导致的以高血糖为特征的内分泌和代谢疾病。其中,以2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的发病率最高,约占糖尿病患者的95%以上。为了深入探讨T2DM的发病机制,国内外学者利用动物模型进行了大量的研究工作。糖尿病实验动物模型的建立有多种方法,判断造模是否成功的指标主要是血糖和尿糖。 淋巴系统(lymphatic system)是循环系统的重要组成部分,由淋巴管道、淋巴器官和淋巴组织组成。在大分子物质(如长链脂肪酸、蛋白和多肽激素)的吸收和转运,炎症扩散和肿瘤细胞转移等诸多生理及病理过程中,发挥极其重要的作用。 胰岛素为多肽激素,由胰岛B细胞分泌入组织间隙后的转运途径,目前尚存在争议。多数学者认为,胰岛素进入毛细血管,直接通过血液转运。在生理状况下,除了通过血管系统之外,胰岛素是否还存在淋巴转运途径呢?有许多研究报道指出,在不同实验对象的胸导管淋巴液中存在胰岛素。这些研究结论提示:胰岛素被分泌入组织液后,胰腺的淋巴系统可能是生理状态下胰岛素的重要转运途径。如果胰岛素通过淋巴管道转运,继而进入体循环血液,运达全身各处的靶器官、靶组织、靶细胞发挥作用,可避免肝脏的“首过效应”。关于胰岛素等大分子物质的正常转运途径是直接进入毛细血管,还是通过毛细淋巴管吸收经淋巴运输间接进入血液,胰淋巴回流受阻是否影响胰岛素的转运,仍需深入研究。同样,淋巴回流受阻对肝肾结构和功能的影响也需要进一步研究。 本实验分为五部分,通过腹部手术结扎家兔胸导管,造成淋巴回流阻滞的实验动物模型;应用光镜和透射电镜,观察正常和实验动物的胰、肝、肾组织的形态学变化;利用生化和放射免疫分析技术,检测正常和实验动物的血糖、血脂、胰岛素、肝功能和肾功能变化;探讨淋巴瘀滞对胰、肝、肾组织结构和功能的影响,实验内容和结果如下: 第一部分淋巴瘀滞家兔模型的建立及其与2型糖尿病的关系 目的:在腹部手术结扎家兔胸导管,造成淋巴回流阻滞,观察实验动物腹腔及胰腺内脂肪堆积情况,检测血糖的变化,希望找到一种新的制造2型糖尿病动物模型的方法。 方法:(1)选用10月龄家兔20只(由河北医科大学实验动物中心提供),雌雄各半,分笼饲养,随机分为两组,实验(手术)组和对照(假性手术)组;(2)结扎胸导管前2-3小时,用植物油5~10毫升灌喂家兔,用6 %水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉,在手术显微镜下,对照组只是充分游离胸导管而不结扎;模型组在腹部膈脚处充分暴露胸导管,并结扎造模。术后的实验动物,常规喂养。(3)术后6个月的实验和对照动物,在6 %水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射深度麻醉下,开腹观察腹部脂肪堆积情况。采取耳梢血测血糖,测血糖前禁食12小时,血糖仪为美国强生Lifescan,血糖试纸Uni-Check。 结果: 1.造模前和造模6个月后腹腔脂肪的变化:(1)造模时,可见腹腔脂肪较少,肠系膜清亮透明,胰腺成淡红的,肾脏周围的脂肪较少,未包裹肾脏。(2)造模成功六个月后,可见腹腔脂肪组织明显增多,肠系膜脂肪组织增厚;胰腺组织辨认困难,有的几乎被脂肪组织所代替;肾周围的脂肪组织明显增多、增厚,包裹并掩盖了肾组织。 2.造模前和造模6个月后血糖的变化:(1)模型组结扎胸导管后血糖明显升高,与结扎前相比具有统计学意义。(2)模型组的血糖高于对照组的,两组间差异具有统计学意义。(3)对照组动物的血糖变化不明显,无统计学意义。 结论:采用腹部手术结扎家兔胸导管的方法,可以建立胰淋巴瘀滞实验动物模型;结扎家兔胸导管的方法可导致腹腔出现大量脂肪沉积,发生血糖逐渐升高现象,这与临床2型糖尿病的发病过程相似。 第二部分结扎家兔胸导管诱发胰组织结构变化的形态学观察 目的:探讨实验性淋巴瘀滞对胰组织细微和超微结构的影响。 方法:(1)选用10月龄家兔20只,随机分为两组,实验(手术)组和对照(假性手术)组;(2)造模后6个月取材,部分胰组织标本做石蜡包埋切片,进行HE、刚果红染色和胰淀肽免疫组织化学染色光镜观察;(3)部分胰腺组织标本制备超薄切片,进行透射电镜观察。 结果: 1.常规HE染色切片的光镜观察:(1)对照组家兔:胰岛大小不等,淡染,胰岛细胞呈簇团状分布,散在于胰腺腺泡之间,或存在于胰腺小叶间结缔组织内;胰腺内较大的导管、血管和淋巴管,常在结缔组织间隙内伴行。(2)模型组家兔:胰岛细胞内出现大量脂滴,甚至可见空泡样变;腺泡细胞内同样可见脂滴存在,甚至呈现空泡样变等现象;胰腺内结缔组织间隙增宽、脂肪组织的堆积、淋巴管样管道结构的扩张。 2.碱性刚果红染色切片的光镜观察:(1)对照组家兔:胰岛及其周围无明显的刚果红着色,胰岛仍呈淡染:(2)模型组家兔:胰岛区域呈现明显的淀粉样物质沉积,胰岛被刚果红染成朱红色;胰腺小叶间隙增宽,呈明显的结缔组织增生现象。 3.免疫组织化学染色切片的光镜观察:胰淀肽免疫反应阳性产物,主要出现在胰胰岛细胞及其周围组织,普遍被染成棕褐色。模型组胰淀肽免疫阳性反应明显增强,被染成深棕褐色,与对照组相比有统计学意义(p0.05)。 4.超薄组织切片透射电镜观察:(1)对照组家兔:胰岛细胞排列紧密,细胞内各类细胞器较丰富,不同形态和大小的分泌颗粒清晰可辨。(2)模型组家兔:胰岛细胞内可见大小和电子密度不同的分泌颗粒;在胰岛B细胞内,有些分泌颗粒的晕环(被认为是胰淀肽存在的区域)明显增宽;有些胰岛细胞内细胞器变得稀疏,细胞核膜模糊不清,出现核染色质边集,甚至核固缩现象,形似细胞凋亡;胰岛细胞间隙明显扩大,在扩大的胰岛细胞间隙内,可见脂滴样和淀粉样物质团块,甚至形成胶原原纤维样结构;此外,在增宽的胰组织间隙内,或增宽的胰岛细胞间隙内,除了存在明显的脂类物质堆积,还常可见到溢出血管外又难以被吸收的红细胞。 结论:淋巴瘀滞对家兔胰组织结构产生影响,如淋巴管扩张、结缔组织间隙增宽、脂肪堆积以及胰淀肽沉积形态学变化;实验性淋巴瘀滞诱发的胰组织结构变化,势必会影响胰腺的外分泌和胰岛的内分泌功能。 第三部分结扎家兔胸导管对肝组织结构和功能影响的观察 目的:探讨实验性淋巴瘀滞对肝组织结构和功能的影响。 方法:(1)选用10月龄家兔20只,随机分为两组,模型(手术)组和对照(假性手术)组;(2)造模后6个月取材,部分肝组织做石蜡包埋切片,HE和免疫组织化学染色进行光镜观察,部分肝组织制作电镜切片并观察。(3)术前和术后6个月的实验动物,在6 %水合氯醛(6 ml/kg)腹腔注射深度麻醉下,穿刺股静脉取血,3000转/分离心后取血清,以检测肝功能。 结果: 1.肝功能结果:模型组家兔的总胆红素、直接胆红素和间接胆红素升高,总蛋白降低、白蛋白降低,球蛋白升高,谷草转氨酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高,和对照组相比有统计学意义(p0.05)。 2.家兔肝脏肉眼观察:对照组大鼠肝脏外形正常,暗红色,被膜光滑;结扎胸导管组肝脏体积明显增大,包膜紧张,边缘钝圆,质地变软,有油腻感,表面无光泽,有脂肪组织包裹。 3.常规HE染色切片的光镜观察:(1)正常对照组家兔:肝组织结构完整清晰,肝小叶结构正常,肝细胞排列整齐,窦索结构清晰,部分肝细胞内见少量脂肪空泡形成伴肝细胞疏松变性;肝血窦含内皮细胞肝巨噬细胞,肝门管区主要是小叶间静脉、动脉和胆管,窦周隙散在有网状纤维和贮脂细胞。未见到肝细胞的坏死。(2)三个月模型组家兔:肝组织切片,组织结构完整清晰,肝小叶结构正常,切片中脂肪细胞数目增多体积变大,且数目时间延长而增多,导致肝发生中度脂肪变性肝细胞肿胀,肝窦间隙变窄;(3)六个月模型组家兔HE观察:肝组织切片,肝脏内脂肪细胞数目增多体积变大,有脂囊形成,发生中、重度脂肪变性,肝细胞出现少量细胞核固缩的坏死现象,肝细胞中有炎细胞浸润,但以淋巴细胞为主,而巨噬细胞未见增多。出现肝组织结构破坏,肝小叶结构异常,未见假小叶。 4.免疫组织化学染色切片的光镜观察:对照组家兔肝组织的瘦素免疫阳性反应,主要位于肝细胞膜。在模型组动物,肝脂肪变和纤维化区域出现瘦素表达明显增强,和对照组相比有统计学意义(p0.05)。 5.超薄组织切片透射电镜观察:(1)对照组家兔:肝细胞核圆形,居中,大小为5~11μm,核内常染色质多,异染色质较少,常位于核周。(2)模型组:肝细胞超微结构明显异常,肝细胞索排列紊乱;肝细胞肿大变圆,细胞膜电子密度减低;细胞核膜迂曲,外层突起,核周隙轻度扩大,核皱缩,核染色质凝集成块状,有的表现出核膜不清或完全消失,细胞核内异染色质增多;细胞质内线粒体大小不一,形态多样,多为圆或椭圆形,部分为不规则形,出现浓缩、肿胀、淡化,外膜破损,有些细胞中可见巨大线粒体;粗面内质网扩张,部分脱颗粒;细胞质内可见大小不等的脂滴,有的成堆出现,有的脂滴挤压细胞核,使之变形;部分肝窦毛细血管化;肝细胞之间可见成纤维细胞以及大量的胶原纤维;窦周隙明显增宽,可见胶原纤维。 结论:淋巴瘀滞导致肝内脂肪的异位储存,随着时间的推移,脂肪肝可进一步发展为脂肪性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化;肝淋巴瘀滞可导致肝功能受损。 第四部分结扎家兔胸导管对肾组织结构和功能影响的观察 目的:探讨实验性淋巴瘀滞对肾组织结构和功能的影响。 方法:(1)选用10月龄家兔20只,随机分为两组,实验(手术)组和对照(假性手术)组;(2)造模后6个月取材,部分肾组织做石蜡包埋切片,HE和免疫组织化学染色进行光镜观察,部分肾组织制作电镜切片并观察。(3)造模前和造模后6个月的实验动物,在6 %水合氯醛(6 ml/kg)腹腔注射深度麻醉下,穿刺股静脉取血,3000转/分离心后取血清,以检测家兔的肾功能。 结果: 1.肾功能结果:模型组家兔的血尿素氮和血肌酐升高,与对照组相比有统计学意义(p0.05); 2.常规HE染色切片的光镜观察:对照组家兔肾小球大小不等,散在于肾组织之间;模型组家兔肾小球可见空泡样变,结缔组织间隙增宽、脂肪组织的堆积、淋巴管样管道结构的扩张等现象。肾小球系膜区有均质团块状嗜伊红物质沉积,基底膜不规则增厚,多伴有肾小动脉壁增厚,并可见均质粉染物质的沉积。 3.免疫组织化学染色切片的观察结果:模型组家兔肾小球淀粉样多肽表达高于对照组,与对照组相比有统计学意义。 4.超薄组织切片透射电镜观察:模型组肾小球萎缩,肾小球系膜区增宽和毛细血管基膜呈弥漫性或结节状增厚,毛细血管基膜内及系膜区见有排列不规则、呈片状分布的纤细的纤维丝结构,即淀粉样纤维,其直径为8~10 nm。肾小管基膜及间质内的毛细血管壁及血管壁的中、内膜也可见有片状淀粉样纤维,血管内皮多脱落。受侵犯的小管上皮细胞表面微绒毛排列不规则,部分缺损,基膜内呈带状或片状的淀粉样纤维分布。同时,由于较多淀粉样物质的增加,使一些肾小管萎缩、增厚、扭曲,肾小管上皮细胞溶解、破损、坏死。 结论:淋巴瘀滞可诱发肾小球空泡样变和淀粉样物质沉积;淋巴瘀滞可导致肾功能损坏。 第五部分结扎胸导管对家兔脂代谢和糖代谢的影响 目的:探讨实验性淋巴瘀滞对糖代谢和脂质代谢影响 方法:(1)选用10月龄家兔20只,随机分为两组,实验(手术)组和对照(假性手术)组;(2)造模前检测正常和实验动物的血糖、血脂、胰岛素;(3)造模后,每周空腹12小时耳缘静脉取血测血糖,到6个月时,取血清测血糖、血脂和胰岛素。 结果: 1.家兔的空腹血糖,结扎后比结扎前升高,差异具有统计学意义; 2.空腹血清胰岛素,模型组血中胰岛素水平下降,与对照组相比差异具有统计学意义; 3.模型组家兔血清游离脂肪酸、甘油三酯和极低密度脂蛋白水平,明显高于对照组,其差异具有统计学意义(P0.01),两组实验动物的血清胆固醇浓度,则无显著性差异。 结论: 1.实验性淋巴瘀滞可导致家兔糖脂代谢异常; 2.结扎胸导管后,淋巴系统并不能迅速和完全建立侧枝循环,预防性结扎胸导管,其利弊得失还需重新审视。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R587.1

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8 副主任医师 韩咏霞;为何妊娠期妇女易发胰岛素抵抗[N];保健时报;2006年
9 刘士敬刘红虹;肝源性糖尿病患者宜早用胰岛素[N];家庭医生报;2007年
10 湘雅二医院 陈化;胰岛素抵抗:糖尿病、心血管疾病的重要危险因素[N];大众卫生报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李全民;1.胰岛素抵抗大鼠G-6-Pase、GK、UCPs基因表达和干预研究 2.PPARα基因变异与2型糖尿病家系血脂的关系[D];重庆医科大学;2003年
2 李宏亮;代谢综合征内皮细胞胰岛素抵抗分子机理研究[D];四川大学;2005年
3 朱伟;摄食抑制因子NUCB2/Nesfatin-1对机体胰岛素敏感性的影响[D];重庆医科大学;2011年
4 付雪艳;西洋参治疗大鼠胰岛素抵抗活性部位筛选及作用机理研究[D];黑龙江中医药大学;2006年
5 伍游雅;益气养阴,活血通腑法对代谢综合征患者外周胰岛素抵抗的影响[D];广州中医药大学;2005年
6 王雪云;Beganatide对实验性糖尿病的治疗作用及机制研究[D];吉林大学;2010年
7 付方明;新诊断标准下糖尿病前期人群代谢状况及胰岛素抵抗与胰岛功能研究[D];山东大学;2010年
8 范征;己糖-6-磷酸脱氢酶和11β-羟基类固醇脱氢酶1的相互调节在2型糖尿病发病机制中的作用[D];吉林大学;2011年
9 朱旅云;超重/肥胖者内皮功能障碍的分子病因学机制及其与胰岛素抵抗和心血管危险因素的相关研究[D];河北医科大学;2002年
10 郭志华;高血压病辩证与胰岛素抵抗相关性及中药干预的临床与实验研究[D];湖南中医学院;2002年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 纪志尚;肥胖患者血清肿瘤坏死因子(INF-α)、游离脂肪酸(FFA)水平变化及其与胰岛素抵抗(IR)相关性研究[D];青岛大学;2002年
2 冉晓丹;疏肝解郁法对2型糖尿病伴抑郁者胰岛素抵抗的研究[D];湖北中医药大学;2010年
3 赵增宇;红活麻总黄酮的制备及防治T2DM-IR作用研究[D];华中科技大学;2009年
4 王蕊;复方丹参饮对胰岛素抵抗型大鼠血管内皮细胞NO、ET-1的影响[D];黑龙江中医药大学;2010年
5 李梅;针刺调节胰岛素抵抗模型大鼠IRS-1、IRS-2和GLUT4的实验研究[D];广州中医药大学;2011年
6 胡淑鸾;不同浓度葡萄糖、胰岛素对兔视网膜Müller细胞糖原合成代谢的影响[D];福建医科大学;2011年
7 陈真;老年冠心病胰岛素抵抗和血小板P-selectin相关性研究[D];中国医科大学;2003年
8 武力勇;心室重塑患者瘦素抵抗与胰岛素抵抗的相关性研究[D];昆明医学院;2010年
9 何颖;2型糖尿病肾病患者血清PON-1、氧化应激、胰岛素抵抗关系研究[D];广西医科大学;2010年
10 冯召岚;金智达胶囊对2型糖尿病脑病大鼠海马胰岛素信号通路的影响[D];大连医科大学;2010年
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