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44个SNPs位点复合分型体系的构建及其法医学应用

娄春光  
【摘要】: 目的:目前,常规STR分型试剂已基本能够解决大部分个体识别及亲子鉴定案例。然而,在许多案例中,DNA样本会由于人为或自然因素而高度降解,无法进行有效STR分型,使案件侦破限于困境。线粒体DNA(mtDNA)高度变异区的分析虽已较为广泛应用,但由于母性遗传,所携带的信息量小,且个体识别力较低,因此应用具有一定的局限性。MiniSTR基因座分析技术通过将PCR引物设计得尽可能靠近重复区域而缩短扩增片段长度,应用于高度降解DNA样本检测,可提高检测成功率,然而,尽管将引物尽可能靠近重复区域,对于等位基因较多的STR基因座,扩增产物长度仍然大于100bp。MiniSTR还存在另一个不足——为了达到个体识别力,一般需要进行不止一次的多重PCR反应,但法医工作者在降解检材中往往得不到足够的可用于模板的DNA量。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)指人类基因组中特定部位的单个碱基序列的变异,其具有突变率低,扩增片段短,适合高通量检测和易于分型等特点,因此在法医学个体识别应用中具有广阔前景。选用可靠的多重分型方法,许多SNPs位点可以在短至45~55bp(变异位点两侧引物序列长度)的扩增片段内分型。在多种SNPs多重检测技术平台中,基于SNapShot试剂盒的引物延伸技术可以一次性检测12个或更多个SNPs位点,因此,当DNA样本严重降解或遇到检材微量时,SNPs分析将更有价值。然而,由于应用于高度降解检材DNA个体识别的SNPs要具备高杂合度、低分化差异及适合高通量技术分析等特点,目前尚未确定一套适合的核心SNPs位点用于个体识别。基于此,本研究的目的是在人类基因组数据库中筛选出符合个体识别标准的一组常染色体SNPs(Individual Identification SNPs, IISNPs),使系统达到个体识别的效能;应用多重PCR联合荧光标记单碱基延伸(Single base extention,SBE)反应技术构建复合分型体系,并对该复合分型体系的法医学应用价值进行评价。 方法:①筛选出至少50个符合个体识别条件的常染色体SNPs位点,根据http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP公布的参考序列,应用引物设计软件,设计50个SNPs位点的PCR引物及单碱基延伸引物。②构建SNPs多重PCR反应体系,将PCR产物经Exonuclease I和shrimp alkaline phosphatase反应纯化后,分为2个体系应用SNapShot试剂盒进行单碱基延伸反应,SBE产物经SAP去除多余的ddNTP后,应用ABI 3130基因分析仪进行检测,3130 Data Collection V3.0软件收集数据,Genemapper ID V3.2软件分析结果,同时完成所有SNPs位点的分型。优化Mg2+和dNTP浓度、退火温度、循环次数以及各位点引物浓度比例等因素,使各位点PCR产物量尽可能均衡,最终构建成SNPs复合分型体系。③应用构建的SNPs复合分型体系调查我国河北地区79份健康无关个体的遗传多态性,通过一系列实验评价该体系的灵敏度、种属特异性和组织统一性;评估SNPs复合分型体系在亲权鉴定和陈旧腐败降解检材DNA分析中的应用价值。 结果:①筛选出了50个常染色体SNPs位点,设计了50个位点的PCR引物及单碱基延伸引物:所有多重PCR反应引物的理论退火温度设计为60±5℃,产物长度在69~125bp之间。单碱基延伸引物长度在20~83个碱基之间,设计其5’端修饰多聚T或多聚CT序列,使引物之间长度差异为3-6个碱基。②经过优化,其中有6个SNPs位点由于检测结果不稳定被舍去,将剩余的44个位点成功构建了SNPs复合分型体系,能够在同一PCR反应体系内同时扩增44个SNPs位点的DNA片段;44个位点分配到2个单碱基延伸反应体系中,复合分型体系1(Plex1)包含26个SNPs位点,复合分型体系2包含18个SNPs位点。③获得了我国河北地区79份健康无关个体44个SNPs位点的群体遗传学数据,抽样人群基因型频率分布符合Hardy-Weinberg平衡,44个SNPs位点的随机匹配概率为5.59×10-19,累积非父排除概率为0.9992633421。该SNPs复合分型体系对标准DNA样品9948的最低检出量为0.0625ng。对恒河猴等非人类生物性检材进行DNA分析,在恒河猴样本中检出16个位点的延伸产物,而其它非人类生物样本中均未检出。亲权鉴定结论与AmpFlSTR? Identifiler?试剂盒的结论一致。在分析陈旧腐败降解检材方面,与AmpFlSTR? Identifiler?试剂盒及miniSTR分型方法进行比较,44个SNPs位点复合分型系统的位点检出率明显提高,具有较高的实际应用价值。 结论:本研究通过自主设计PCR和单碱基延伸反应引物,成功构建了一个包含有44个高杂合度、低人群分化差异SNPs位点的复合分型体系。法医学可行性研究结果显示,该复合分型系统可以应用于法医学实际检案中,在分析陈旧腐败降解检材时可作为STR分析的有效补充。


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