白藜芦醇对梗阻性黄疸大鼠肾损伤的保护作用

【摘要】： 梗阻性黄疸(obstructive jaundice, OJ)导致肠黏膜屏障功能损伤,从而产生一系列并发症,如败血症和肾功能衰竭等。OJ引起肾功能损害的原因未明,可能是由于严重肝功能障碍导致肾脏的血流动力学改变所致,其肾脏血流动力学改变的特征是:肾内血管收缩,肾脏血流重新分布,血流自肾皮质向髓质分流,肾皮质缺血,肾小球入球小动脉收缩,肾小球滤过率下降。另外,OJ时可产生肠源性内毒素血症(endotoxemia, ETM),胆道梗阻时由于细胞外液及细胞内液的减少以及存在的内毒素血症从而引起氧自由基增多,导致体内活性氧蓄积并对机体产生损伤作用,机体抗氧化机制不足以清除过多的氧自由基,产生氧化应激损伤而加重肾功能损害。 血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血红素分解起始代谢的限速酶。HO在降解血红素的过程中减少活性氧类物质的产生。在这个过程中它可以产生相同量的一氧化碳和胆绿素,同时释放出铁离子。临床研究表明血红素的增加可以导致急性肾小管坏死,而HO系统可以减少肾组织损害。HO有三种亚型,HO-1、HO-2、HO-3,其中HO-1为可诱导型。HO-1在氧化应激反应的诱导下产生并对抗氧化应激的损伤。血红素的代谢产物一氧化碳、胆绿素和铁离子均具有抗氧化和抗细胞凋亡的作用。白藜芦醇(resveratrol, Res)是一种在桑椹、葡萄和红酒中发现并提取出来的多聚苯复合物,已经有研究发现白藜芦醇通过诱导HO-1的表达表现出广泛的生物作用包括抗氧化、抗癌及抗炎症作用。 目的:本实验通过研究OJ大鼠肾脏HO-1、ZO-1、occludin表达水平及其在损伤中的作用,探讨白藜芦醇对BDL大鼠肾脏HO-1水平的影响及其在氧化应激损伤中的保护作用及机制。 方法:采用健康雄性wistar大鼠,BDL方法制备动物模型,共60只。白藜芦醇用1%羧甲基纤维素钠制成白藜芦醇混悬液。随机分为5组:假手术组(sham operation, SO),胆总管结扎组(BDL),胆总管结扎+溶剂组(BDL+Vehicle),胆总管结扎+不同浓度白藜芦醇组(10 mg/kg, 20mg/kg)(BDL+Res 10 mg/kg, 20 mg/kg)。分别于术后1 wk、2 wk留取标本。采用HE染色观察肾脏形态学变化;透射电镜观察肾脏的超微结构;鲎试剂终点显色法检测血浆内毒素(endotoxin, ET)含量;硫代巴比妥酸法检测肾组织匀浆中丙二醛(malonaldehyde, MDA)含量、黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活力;原位缺口末端标记技术即TUNEL染色检测肾脏细胞凋亡情况;免疫组织化学(SP)法检测HO-1及紧密连接蛋白ZO-1、occludin的表达与定位;Real time PCR和western blot方法检测HO-1在肾脏的表达水平。 结果: ⑴肝功能结果证明BDL大鼠模型制作成功。 ⑵光镜下肾组织病理学显示:BDL组和BDL+Vehicle组大鼠于胆管结扎术后1 wk肾近曲小管上皮细胞开始出现轻度肿胀,术后2 wk肾近曲小管上皮细胞水肿较1 wk时加重。Res治疗后肾近曲小管上皮细胞较单纯BDL组水肿轻。 ⑶透射电镜观察肾脏超微结构:BDL组和BDL+Vehicle组大鼠于胆管结扎术后1 wk时肾小球滤过屏障表现为基底膜轻度增生,足突及内皮细胞轻度增生融合,近曲小管线粒体大部分嵴和膜融合,可见空泡。粗面内质网有轻度颗粒融合和脱颗粒现象;术后2 wk肾小球滤过膜病变加重,足细胞和基底膜重度增生,融合成一片,血管内皮细胞重度增生,近曲小管细胞质内可见大量髓样化致密化的线粒体。Res组线粒体正常,但粗面内质网仍可见融合和脱颗粒现象。 ⑷大鼠血浆内毒素(endotoxin, ET):BDL组ET水平在各时段明显高于SO组(P0.01),Res 10 mg/kg, Res 20 mg/kg组大鼠术后2 wk ET水平低于同时段BDL组(P 0.05, P0.01)。 ⑸内生肌酐清除率(creatinine clearance, Ccr)和尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretory, Uaer):与SO组比较,BDL组血清Ccr水平在术后2 wk时明显下降(P0.01),Uaer水平于术后1 wk时明显升高(P0.01),2 wk时更显著(P0.001)。BDL+Res 2 wk治疗组Ccr水平较同时相BDL组与BDL+Vehicle组升高(P0.05),Uaer水平下降(P0.01),但各治疗组无明显差别(P0.05)。 ⑹肾组织MDA、SOD含量的变化:BDL组肾组织脂质过氧化产物MDA水平在各时段明显高于SO组(P0.01),SOD活力明显低于SO组(P0.01);Res组大鼠术后2 wk MDA水平低于同时段BDL组(P0.05),SOD活力明显高于同时段BDL组(P0.01),但各治疗组无明显差别(P0.05)。 ⑺肾组织ZO-1、occludin免疫组织化学检测:BDL大鼠术后2 wk肾脏ZO-1阳性细胞数减少,光密度(OD)值BDL组(0.10±0.02)明显低于SO组(0.17±0.00)(P0.01),BDL+Res组(0.12±0.01,0.12±0.01)较同时段BDL组增加(P0.05),但各治疗之间无明显差别(P0.05);BDL大鼠术后2 wk肾脏occludin阳性细胞数减少,OD值BDL组(0.09±0.02)明显低于SO组(0.14±0.01)(P0.01),BDL+res组(0.12±0.01,0.13±0.01)较同时段BDL组增加(P0.01),但各治疗组之间无明显差别(P0.05)。 ⑻肾组织HO-1免疫组织化学检测:BDL大鼠在术后2 wk大鼠肾脏HO-1阳性细胞数及细胞浆内黄染颗粒增加,OD值BDL组(0.14±0.01)明显高于SO组(0.05±0.01)(P0.01),BDL+res组(0.24±0.03,0.17±0.01)与BDL组比较明显升高(P0.01),10 mg组好于20 mg组。 ⑼Western blot印迹半定量检测肾组织HO-1表达:Western印迹分析显示约相对分子质量32kDa处可见杂交蛋白条带,2 wk组BDL组A值百分比(HO-1/GAPDH)(0.63±0.06)高于SO组(0.25±0.07)(P0.01),BDL+Res 10mg/kg治疗组(0.81±0.05)高于同时段BDL组(P0.01),10 mg组好于20 mg组。 ⑽Real time PCR分析结果显示:BDL组大鼠肾组织HO-1 mRNA表达(3.76±0.77)高于SO组(1.00±0.00)(P0.05),BDL+res 10 mg/kg组(6.13±1.29)与同时段BDL组比较升高(P0.05),10 mg组好于20 mg组。 结论: ⑴梗阻性黄疸大鼠存在内毒素血症、肾脏氧化应激损伤和肾脏细胞凋亡。 ⑵梗阻性黄疸大鼠肾脏上皮细胞间紧密连接蛋白表达减少。 ⑶梗阻性黄疸大鼠肾脏HO-1蛋白及mRNA表达增多。 ⑷白藜芦醇可以通过诱导肾脏HO-1的表达来达到抗氧化应激、抗凋亡的作用。

【关键词】：白藜芦醇 梗阻性黄疸 肾脏 血红素加氧酶 紧密连接 细胞凋亡 氧化应激 内毒素 内生肌酐清除率
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R285.5
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