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药物质量控制与体外代谢研究

孙倩  
【摘要】: 盐酸双苯氟嗪(Dipfluzine hydrochloride)是河北医科大学药学院自行研制开发的创新药物,属于哌嗪类钙拮抗剂。可以选择性地扩张基底动脉血管、椎动脉血管及冠状动脉血管等。且对脑血管的选择性作用强于氟桂利嗪。另外发现它可以降低脑水肿、增加脑血流量、改善脑缺血症状、缩小梗塞范围,同时还具有抗血小板凝聚和血栓形成的作用,能显著保护大鼠缺血性脑损伤,有可能成为治疗缺血性脑血管疾病的新药。目前正处于临床前研究。本试验对盐酸双苯氟嗪及其制剂进行全面研究,为其质量标准的制定奠定基础。并利用微生物转化法进一步研究盐酸双苯氟嗪的代谢,发现并推测代谢产物结构。 克拉维酸钾(clavulanate potassium)是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种β-内酰胺酶抑制剂,它与该酶可发生不可逆的结合使酶失活,可提高阿莫西林对其耐药菌的活性,故临床常使用二者的复方制剂。目前,该药物的含量测定一般采用高效液相色谱(HPLC)法。本试验采用毛细管区带电泳(HPCE)法和液相色谱-质谱联用(LC-MS)法,测定了克拉维酸钾及其制剂的含量。 第一部分盐酸双苯氟嗪原料药的质量控制方法研究 目的:研究盐酸双苯氟嗪原料药与质量有关的理化性质,为其质量标准的制定奠定基础。 方法:(1)物理常数:①溶解度:按照中国药典(2005年版二部)凡例规定的方法对盐酸双苯氟嗪在常见溶剂中的溶解度进行了考察。②熔点:按照中国药典(2005年版二部)附录ⅥC熔点测定法第一法测定。(2)鉴别:①化学法:取盐酸双苯氟嗪适量,溶于一定量的水中,加热使溶解,放冷后,加生物碱沉淀剂,观察发生的现象。按照中国药典(2005年版二部)附录Ⅲ鉴别有机氟化物、氯化物。②紫外光谱法:取盐酸双苯氟嗪供试品及对照品适量,加无水乙醇溶解并稀释成每1 ml含18μg的溶液,在200~400 nm波长范围内进行光谱扫描。③高效液相色谱法:取盐酸双苯氟嗪供试品适量,加流动相制成每1 ml含0.1 mg盐酸双苯氟嗪的的溶液,以缓冲溶液-乙腈-甲醇(43:10:47,用磷酸调节pH值至3.5)为流动相,在230 nm的波长处检测。记录色谱图,并与对照品图谱比较。(3)检查:①一般杂质检查:参照中国药典(2005年版二部)附录,对盐酸双苯氟嗪的炽灼残渣、重金属、氟化物进行检查。②有关物质检查:采用高效液相色谱法检查有关物质。(4)含量测定:采用非水电位滴定法、紫外分光光度法和高效液相色谱法分别测定盐酸双苯氟嗪的含量,并对3种方法学进行比较。 结果:(1)物理常数:①溶解度:在氯仿、甲醇中易溶,在乙醇、乙酸乙酯中溶解,在丙酮、0.1 mol/L的盐酸溶液中略溶,在水、苯、乙醚、0.1 mol/L的氢氧化钠溶液中几乎不溶。②熔点:盐酸双苯氟嗪的熔点为212℃~215℃。(2)鉴别:①化学法:加入生物碱沉淀剂后,产生白色沉淀。氯化物和氟化物鉴别呈正反应。②紫外光谱法:供试品在228 nm和243 nm有两个吸收峰,与对照品紫外图谱一致。③高效液相色谱法:盐酸双苯氟嗪供试品所显主峰的保留时间与对照品一致。(3)检查:炽灼残渣小于0.20 %;重金属含量小于10 ppm;氟化物含量均小于理论值。②有关物质检查:HPLC法确定色谱条件为:Restek C18柱,流动相为缓冲溶液-乙腈-甲醇(43:10:47),检测波长为230 nm,流速为1 ml/min,最低检测限为2.0 ng。(4)含量测定:3种方法的含量测定结果基本一致,样品含量均大于98.5 %。确定非水电位滴定法为含量测定方法。 结论:本文建立了盐酸双苯氟嗪鉴别、检查和含量测定的方法,为其质量控制提供了依据,可有效控制盐酸双苯氟嗪的质量。 第二部分注射用盐酸双苯氟嗪的质量控制方法研究 目的:研究注射用盐酸双苯氟嗪的鉴别、检查、含量测定等方法,为其质量标准制订奠定基础。 方法:(1)鉴别:①化学法:取本品细粉适量,溶于一定量的水中,溶解,加生物碱沉淀剂,观察发生的现象。按照中国药典(2005年版二部)附录Ⅲ鉴别氯化物。②紫外光谱法:取本品细粉适量,加无水乙醇溶解,过滤,制成每1 ml含18μg盐酸双苯氟嗪的溶液,在200~400 nm波长范围内进行光谱扫描。③高效液相色谱法:取本品细粉适量,加流动相制成每1 ml含0.1 mg盐酸双苯氟嗪的溶液,以缓冲溶液-乙腈-甲醇(43:10:47,用磷酸调节pH值至3.5)为流动相,在230 nm的波长下检测。记录色谱图,并与对照品图谱比较。(2)检查:①有关物质:采用高效液相色谱法对注射用盐酸双苯氟嗪的特殊杂质进行检查。②装量差异:按照中国药典(2005年版二部)附录要求检查粉针剂的装量差异。(3)含量测定:采用紫外分光光度法、高效液相色谱法和毛细管区带电泳法分别测定注射用盐酸双苯氟嗪的含量,并对3种方法进行比较。 结果:(1)鉴别:①化学法:加入生物碱沉淀剂后,产生白色沉淀。氯化物鉴别呈正反应。②紫外光谱法:供试品在228 nm和243 nm的波长处有两个吸收峰。③高效液相色谱法:供试品图谱中盐酸双苯氟嗪峰的保留时间与对照品保留时间一致。(2)检查:①有关物质:杂质限量为2.0 %,最低检测限为2.0 ng,该法灵敏度高。②装量差异:该制剂的装量差异符合规定。(3)含量测定:3种方法的测定结果基本一致,辅料对三种测定方法均无干扰。选用高效液相色谱法作为含量测定方法。 结论:本文建立了注射用盐酸双苯氟嗪的鉴别、检查、含量测定的方法,为考察该制剂的质量提供了可靠方法。 第三部分盐酸双苯氟嗪的体外代谢研究 目的:通过微生物转化、肠道菌厌氧培养法寻找代谢物,并推测结构。 方法:(1)微生物转化实验:经过筛选,选出转化能力强的菌株对盐酸双苯氟嗪进行转化,制备少量转化产物单体,通过MS数据对其结构进行确认。(2)肠道菌培养:取大鼠粪便,利用肠道菌厌氧培养的方法,研究盐酸双苯氟嗪的代谢产物,采用HPLC-PDA分析。 结果:微生物转化实验,经筛选发现侧孢霉(Sporotrichum sp.,AS 3.2882)对盐酸双苯氟嗪的代谢能力强,重现性好,由此得到转化产物,推测其结构为1-二苯甲基-4-(4-氟苯基-4-羟基)丁基哌嗪(以M表示)。肠内菌厌氧培养液中未发现代谢物。 结论:通过微生物转化法得到转化产物,推测了其化学结构。 第四部分毛细管区带电泳法测定克拉维酸钾及其制剂的含量 目的:建立简便、快速分析克拉维酸钾及其制剂含量的毛细管区带电泳方法。 方法:采用非涂层石英毛细管柱,有效长度50 cm;运行缓冲溶液:20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0);工作电压25 kV;进样电压20 kV,进样时间5 s;柱温20℃;检测波长214 nm。 结果:克拉维酸钾在0.05208~0.3125 mg/ml范围内线性关系良好,相关系数为0.9996(n=6)。阿莫西林克拉维酸钾(7:1)分散片中克拉维酸钾的平均回收率(n=9)为99.2 %,RSD为0.77 %;阿莫西林克拉维酸钾(4:1)干混悬剂中克拉维酸钾的平均回收率(n=9)为99.4 %,RSD为1.0 %;最低检测限为1.953μg/ml。 结论:本方法简便、准确、快速,为克拉维酸钾及其制剂的质量控制提供了一种新的分析手段。 第五部分LC-MS法测定克拉维酸钾及其制剂的含量 目的:建立液相色谱-质谱联用法,测定克拉维酸钾及其制剂的含量。 方法:采用Restek C18色谱柱,流动相:5 mmol/L醋酸铵溶液-乙腈(90:10),流速:0.7 ml/min,柱温:25℃,采用ESI离子源,多反应监测(MRM)扫描方式,负离子模式。 结果:克拉维酸钾在10.33~1033 ng/ml范围内线性关系良好,相关系数为0.9989(n=6)。阿莫西林克拉维酸钾(7:1)分散片中克拉维酸钾的平均回收率(n=9)为98.5 %,RSD为1.2 %;阿莫西林克拉维酸钾(4:1)干混悬剂中克拉维酸钾的平均回收率(n=9)为99.0 %,RSD为1.1 %;最低检测限为1.033 ng/ml。 结论:本方法准确、快速,为克拉维酸钾及其制剂生产中的质量控制提供了一种新的可靠的分析手段。


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