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《河北医科大学》 2010年
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SphK2在急性脑梗死大鼠脑组织的动态表达及氧化苦参碱的神经保护作用

杨蕊  
【摘要】: 目的:缺血性脑血管病是常见病、多发病,病死率和致残率均高。脑缺血后继发性脑损伤是一个复杂的病理过程,其中细胞内Ca2+稳态失调在脑缺血的发病机制中起着重要作用。细胞内钙超载使受Ca2+调节的多种酶类被激活,导致膜磷脂分解和细胞骨架破坏,从而造成细胞的凋亡坏死。鞘氨醇激酶(Sphingosine kinase,SphK)是催化鞘氨醇磷酸化为1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)的关键酶,其中,SphK2由于其催化活性以及在细胞的特殊定位而影响着细胞内Ca2+的水平,进而发挥着促凋亡的作用。氧化苦参碱(Oxymatrine, OMT)是从豆科槐属植物苦参(Sophora flavescens Ait)中提取的生物碱,具有四环喹嗪啶类结构。OMT具有抗炎、抗氧化、抗病毒及调节免疫等多方面药理作用,但其作用机制尚不完全明确,近几年对于OMT的研究很多,多集中在抗肿瘤及抗心肌梗死等方面,关于OMT在脑梗死中作用的研究较少。本实验以线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型,应用Western Blot, RT-PCR和免疫组织化学技术测定脑梗死后SphK2的动态表达规律;应用OMT作为干预药物,研究OMT对脑梗死后脑水肿、脑梗死体积及SphK2表达的影响,旨在探讨OMT在脑梗死中的脑保护作用及其作用机制。 方法:成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠应用Longa等的线栓法建立永久性大脑中动脉阻塞脑缺血模型。实验一用来观察SphK2在脑缺血后的动态表达。分为两组:正常组和MCAO组。MCAO组包括6个时间点:3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h。分别应用免疫组化、Western Blot以及逆转录多聚酶链反应(Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)检测脑组织中SphK2的表达变化情况。实验二用来研究OMT对SphK2及血脑屏障紧密连接蛋白claudin-5的影响。大鼠被随机分成3组:假手术组(Sham)、MCAO组、OMT组(MCAO + OMT 120 mg/kg)。脑缺血模型制成后立刻腹腔注射OMT,假手术组及MCAO组给予等容量生理盐水,手术后24 h对大鼠进行神经功能评分。评分完毕将动物断头处死,用干湿重法测定脑组织含水量,用2% 2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride, TTC)染色法测算脑梗死体积,用免疫组化、Western Blot及RT-PCR来观察SphK2及claudin-5的表达情况。 结果: 1与正常对照组相比,MCAO组SphK2于脑缺血后12 h开始升高,72 h达高峰(P 0.05)。 2 OMT可以改善神经功能的缺失,降低脑水肿以及脑梗死面积。与MCAO组相比,OMT组行为学评分下降(P 0.05);脑水肿含量减少(MCAO vs. OMT: 83.08±0.56 vs. 81.00±0.43, P 0.01);脑梗死面积减少(MCAO vs. OMT: 46.66±3.36 vs. 26.01±6.10, P 0.01)。 3 OMT下调SphK2的表达。脑缺血后,缺血灶周围脑组织SphK2阳性细胞数、蛋白水平以及mRNA表达水平均上升,给予OMT后,其表达下调(Western Blot: MCAO vs. OMT: 2.21±0.34 vs. 1.74±0.06, P 0.05; RT-PCR: MCAO vs. OMT: 0.45±0.01 vs. 0.34±0.02, P 0.05)。 4 OMT可以改善血脑屏障的通透性。与假手术组相比,脑缺血后claudin-5表达明显下降。RT-PCR以及Western Blot均显示OMT可以上调缺血脑组织内claudin-5的表达(RT-PCR: MCAO vs. OMT: 0.47±0.04 vs. 0.55±0.01, P 0.05; Western Blot: MCAO vs. OMT: 0.95±0.04 vs. 1.25±0.14, P 0.05)。 结论:SphK2在脑缺血的损伤过程中表达上调,给予OMT干预后可以有效减少神经系统损伤以及组织损伤。其作用可能与下调SphK2,抑制凋亡;上调claudin-5,改善血脑屏障有关。
【学位授予单位】:河北医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R743.3;R285.5

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