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《河北农业大学》 2011年
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草莓乙烯受体Etr1基因克隆及其植物表达载体的构建

汪丽  
【摘要】:草莓是一种经济价值很高的果品,但果实采后极易软化腐烂,不耐贮运,造成很大的经济损失。乙烯受体Etr1基因在草莓果实成熟阶段表达较多,可能与果实的成熟密切相关。深入研究Etr1基因功能将有助于揭示乙烯受体与非跃变型果实成熟的关系,从而为采用生物技术手段提高草莓果实的贮运性能奠定基础。为此,本研究以全明星草莓基因组DNA为模板,PCR扩增到了草莓乙烯受体Etr1基因片段,构建了该基因的反义和RNA干扰植物表达载体。主要结果如下: (1)根据已发表的Chandlar草莓乙烯受体Etr1的保守氨基酸序列,设计了一对特异性引物,PCR扩增得到一个长617bp的基因片段,序列分析表明该片段与GenBank中Chandlar草莓Etr1基因核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性高达98%,无内含子序列。说明克隆到的片段是全明星草莓Etr1基因片段。 (2)将克隆到的全明星草莓Etr1核苷酸序列反向克隆到了pBI221质粒的XbaⅠ-BamHⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-anti-Etr1。用SmaⅠ和HindⅢ酶切构建好的中间载体pBI221-anti-Etr1和pBI121质粒,切下中间载体质粒上的CaMV 35S启动子和Etr1的反义序列,将其定向插入到切除CaMV 35S启动子的pBI121质粒中,构建成反义表达载体pBI121-anti- Etr1。 (3)将Etr1的序列正向插入到中间载体pBI221质粒的BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点之间,构建成中间表达载体pBI221-sense-Etr1。用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切构建好的反义表达载体pBI121-anti- Etr1和中间载体pBI221-sense-Etr1。切下中间载体质粒上的GusA、NOS终止子和正义序列,将其插入到切除了GusA和NOS终止子的pBI121-anti-Etr1质粒中,构建成RNAi植物表达载体pBI121- Etr1-RNAi。 (4)利用冻融法将pBI121-anti-Etr1、pBI121-Etr1-RNAi两个植物表达载体转化到农杆菌LBA4404中,经特异性引物对转化菌液的PCR扩增,证实表达载体已转入农杆菌。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S668.4

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【参考文献】
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