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《河北农业大学》 2011年
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基于质粒表达的siRNA对猪圆环病毒2型体内外复制的抑制效应

李曼  
【摘要】:猪圆环病毒2型(PCV2)引起的猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)是危害当今全球养猪生产的最重要的免疫抑制性疫病。目前仍没有防治该病的理想疫苗和药物,因此研究预防和治疗PCVAD的新制剂具有重要的理论和实践意义。RNA干扰(RNAi)是由双链小干扰(siRNA)引起的序列特异性的转录后基因沉默现象,该技术在传染性疾病、恶性肿瘤、心血管疾病等的治疗研究领域发展极为迅速。本研究构建了PCV2特异的siRNA表达质粒,分析了其对PCV2增殖和致病性的抑制作用。 针对PCV2的rep和cap基因,筛选了10个siRNA靶序列,设计并合成了10对编码PCV2特异的shRNA的DNA寡核苷酸和1对PCV2非特异(SCR)的shRNA的DNA寡核苷酸。将11对DNA寡核苷酸退火形成双链,克隆到siRNA表达质粒pGensil-1的U6启动子下游,构建了PCV2特异的siRNA表达质粒(pGensil-C123、C297、C490、C563、C645、R148、R259、R295、R484、R601)和对照质粒(pGensil-SCR)。在脂质体介导下将构建的siRNA表达质粒转染PK-15细胞,20 h后感染500 TCID50的PCV2。应用实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白免疫印记(Western-blot)和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)等技术检测病毒DNA、mRNA及蛋白的合成与表达情况。结果表明,构建的PCV2特异的siRNA表达质粒均能不同程度地抑制PCV2 DNA、mRNA及Rep与Cap蛋白在PK-15细胞内的合成,其中针对C297、C490和R259三个靶位的siRNA的抑制效果更好。进一步研究发现,质粒转染后16 h即可抑制PCV2的复制,且直到接毒后72 h仍有明显的抑制作用;当siRNA表达质粒的转染剂量为1μg时,病毒DNA浓度显著低于转染0.25μg、0.5μg时的浓度;针对两个或三个靶位的siRNA表达质粒混合转染PK-15细胞对PCV2的抑制作用显著增强。上述结果提示PCV2特异的siRNA表达质粒对病毒的抑制作用具有长效性和剂量依赖性,针对不同靶位的siRNA表达质粒混合转染对PCV2具有抑制协同效应。 将128只8周龄BALB/c随机分为8组,每组16只。第1、2组分别为只感染病毒的阳性对照(PC)组和不感染病毒的阴性对照(NC)组;第3、6组分别为空质粒和SCR对照组,第4、5组为接种一种质粒组,第7、8组为两种质粒混合组。其中第3~7组先接种质粒24 h后感染PCV2;第8组先感染PCV2,24 h后接种质粒。质粒和病毒均通过腹腔与鼻腔途径接种,质粒接种剂量为50μg/只,PCV2(105 TCID50/0.1 mL)的感染剂量为0.1 mL/只。结果PCV2感染21 d后,接种siRNA表达质粒的各组小鼠的体重均显著高于PC、空质粒和SCR对照组的体重(P0.05),混合质粒组的体重较单质粒组的高(P0.05)。与PC、空质粒和SCR对照组相比,接种siRNA表达质粒组的抗体水平、血清中PCV2核酸检出率以及组织中的PCV2载量均显著降低(P0.01)。淋巴结和脾脏的淋巴细胞减少、多核巨嗜细胞浸润等显微病变轻微,到感染后21 d恢复正常。与接种一种siRNA表达质粒相比,混合质粒对PCV2在小鼠体内的增殖及其致病性的抑制效果更好。PCV2感染前较感染后接种siRNA表达质粒的小鼠组织中的病毒载量低,提示PCV2感染前使用siRNA表达质粒对病毒的抑制效果更佳。应用PCR对组织中siRNA表达质粒的检测结果表明,质粒能够在小鼠体内长期稳定存在(至少能存在28 d)。 综上所述,本研究证明基于质粒表达的PCV2特异的siRNA能够在体内和体外有效抑制PCV2的增殖,显著降低PCV2的致病性,针对不同靶位的siRNA的抑制作用存在差异,不同siRNA的抑制效果具有协同作用,siRNA表达质粒能够在组织中长期稳定表达siRNA,发挥抑制效果。这些结果为进一步研发防治PCVAD的新制剂提供了科学依据。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S852.65

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
1 马增军;芮萍;宋勤叶;张艳英;杨彩然;张飞;;猪圆环病毒2型感染的流行病学调查[J];畜牧与兽医;2009年03期
2 汤富酬,薛友纺;RNA干涉与基因沉默[J];遗传;2001年02期
3 韩蓓,王秀敏,顾学范;双链RNA干涉技术(RNAi)在不同生物中应用的研究进展[J];遗传;2002年02期
4 郎洪武,张广川,吴发权,张创贵;断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J];中国兽医科技;2000年03期
5 王涛,王子轼,彭德旺;猪圆环病毒感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征[J];中国兽医学报;2002年03期
6 王忠田,杨汉春,郭鑫;规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查[J];中国兽医杂志;2002年10期
7 ;RNA interference and antiviral therapy[J];World Journal of Gastroenterology;2007年39期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王子馨;李坤;崔保安;王淑娟;陈红英;张宇耕;;猪细环病毒和猪圆环病毒2型混合感染的检测[J];安徽农学通报(上半月刊);2012年09期
2 王丽荣;;猪圆环病毒的病原学与诊断[J];安徽农业科学;2006年06期
3 靳玉芬;;检测猪圆环病毒2型DNA的套式PCR方法的建立及应用[J];安徽农业科学;2007年07期
4 陈杨;徐志文;郭万柱;陈弟诗;;猪圆环病毒2型的致病机理和疫苗研究进展[J];安徽农业科学;2007年18期
5 徐涤平;杨克礼;梁望旺;刘泽文;段正赢;熊忠良;伍锐;;猪病混合感染对临床诊断的影响[J];安徽农业科学;2007年36期
6 欧阳素贞;张福良;王双山;;豫北地区猪圆环病毒2型感染的血清学调查[J];安徽农业科学;2008年04期
7 杭柏林;刘丽艳;王宪文;王丽荣;李银曼;胡建和;;检测猪圆环病毒2型PCR方法的建立[J];安徽农业科学;2008年16期
8 曹素芳;李明;王岩;刘长斗;朱赞梅;唐桂芬;肖松云;;靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定[J];安徽农业科学;2009年28期
9 焦海宏;王晶钰;任敏;李晓成;;南疆地区某猪场猪圆环病毒Ⅱ型的PCR检测[J];安徽农业科学;2009年36期
10 万小荣;莫爱琼;杨妙贤;余土元;;植物基因沉默机制研究进展[J];安徽农业科学;2011年17期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 梁鹏帅;蔡汝健;刘燕玲;孙瑞芹;张龙现;宋长绪;;华南地区猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒检测分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 曾思遥;张淑琼;余绍华;唐志玲;陈瑞爱;罗满林;;TaqMan实时荧光定量PCR检测PCV2方法的建立[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 王贵华;陈义锋;张工;刘明明;赵亚荣;;猪圆环病毒2型毒株分离鉴定[A];新型疫苗研发及基因工程疫苗应用研讨会论文集[C];2010年
4 李曦;符芳;王靖飞;崔尚金;童光志;;断乳仔猪多系统衰竭综合征的病原学调查[A];2005辽宁省畜牧兽医学会养猪研究会学术年会论文集[C];2005年
5 宋云峰;肖少波;金梅林;张松林;陈焕春;;PCV2 ORF2自杀性DNA疫苗的构建及免疫效果初步研究[A];生命科学与微生物专辑[C];2004年
6 杭柏林;胡建和;丰兰竹;王丽荣;王宪文;;一种检测猪圆环病毒2型PCR方法的初步建立[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
7 王宪文;姚四新;张智勇;刘兴友;;河南省猪圆环病毒流行情况初步调查与分析[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
8 郭晓红;周忠孝;吴明煜;;RNA干涉的分子机制及技术研究进展[A];中国生理学会论文汇编2005年第一期[C];2005年
9 郑敏;;猪2型圆环病毒病病原学研究[A];福建省科协第八届学术年会分会场“转变饲养方式,促进海西畜牧业和谐发展”学术年会论文集[C];2008年
10 银梅;唐海蓉;陈桂香;王选年;王新华;;断奶仔猪多系统衰弱综合征[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 冯宝珍;辣椒疫霉(Phytophthora capsici)诱导坏死蛋白基因克隆及功能研究[D];山东农业大学;2011年
2 吴成利;ALDH1A1在胃癌中的表达及对胃癌细胞生物学的作用[D];第二军医大学;2011年
3 姬广辉;无感染增强的广谱抗登革病毒中和抗体的构建及机制研究[D];第二军医大学;2011年
4 尹双辉;猪圆环病毒2型衣壳蛋白病毒样颗粒的制备及其免疫原性的研究[D];中国农业科学院;2011年
5 邓盎;利用RNAi技术抑制ERβ表达对人成骨细胞株hFOB 1.19中TGF-β1和BMP-2表达的影响[D];中南大学;2011年
6 石凤敏;蒙古冰草MwLEA3基因功能研究及MwRRT基因的克隆[D];内蒙古农业大学;2011年
7 邓治邦;猪圆环病毒病小鼠动物模型的研究[D];湖南农业大学;2011年
8 陈杨;PPV和PCV2核酸疫苗及PRV-PPV-PCV2基因工程疫苗的研究[D];四川农业大学;2011年
9 邢福珊;PCV-2 ORF2蛋白在杆状病毒表面的展示及动物免疫试验[D];西北农林科技大学;2011年
10 彭冬先;慢病毒介导短发夹状RNA抑制survivin基因治疗子宫内膜异位症的实验研究[D];南方医科大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 宋飞;猪圆环病毒2型(WH株)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒混合感染致病性的研究[D];华中农业大学;2010年
2 张敏;猪圆环病毒2型感染猪肺泡巨噬细胞的蛋白质组学研究[D];华中农业大学;2010年
3 张玉丹;猪圆环病毒2型(WH株)灭活疫苗效力的研究——PCV2在肠、肾的分布变化[D];华中农业大学;2010年
4 逄莎莎;PCV2人工感染对仔猪免疫器官的影响以及PCV2-WH株灭活疫苗的保护作用研究[D];华中农业大学;2010年
5 车楠;SublyticC5b-9诱导Gadd45γ表达对Thy-1肾炎GMCs凋亡病变的影响[D];南京医科大学;2009年
6 席力森;慢病毒载体介导siRNA对乙型肝炎病毒抑制作用的体内研究[D];南京医科大学;2009年
7 刘丽莎;SublyticC5b-9诱导IRF-1表达对Thy-1肾炎大鼠GMCs凋亡病变的影响[D];南京医科大学;2010年
8 祁艳华;猪圆环病毒2型ELISA抗体检测方法的建立及PCV2单克隆抗体的制备[D];郑州大学;2010年
9 杨海芳;心叶烟RNA依赖的RNA聚合酶6(NgRDR6)基因的分离及功能分析[D];山东农业大学;2010年
10 苏金存;猪圆环病毒2型油乳剂灭活疫苗及其免疫效力研究[D];安徽农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 唐锦辉;闫之春;;美国养猪业考察报告[J];猪业科学;2007年09期
2 李鹏,李凯伦,王建军,逯纪成,崔玉苍;河北省猪Ⅱ型圆环病毒的血清学调查[J];畜牧兽医科技信息;2004年08期
3 ;Inhibition of genes expression of SARS coronavirus by synthetic small interfering RNAs[J];Cell Research;2005年03期
4 汤富酬,薛友纺;RNA干涉与基因沉默[J];遗传;2001年02期
5 贾赟,芦银华,张素芳,周斌,陈溥言;猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪细小病毒混合感染的流行病学调查[J];中国病毒学;2004年05期
6 郎洪武,张广川,吴发权,张创贵;断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测[J];中国兽医科技;2000年03期
7 吕艳丽,杨汉春,郭鑫;用PCR方法检测猪圆环病毒Ⅱ型[J];中国兽医学报;2002年06期
8 王忠田,杨汉春,郭鑫;规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查[J];中国兽医杂志;2002年10期
9 王芳;盖新娜;郭鑫;杨汉春;;猪圆环病毒2型BF株感染性分子克隆系列突变株的构建[J];中国兽医杂志;2007年12期
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1 席晓蓉,孙强明,孙茂盛;RNA干扰抗HIV1的基本策略及其优化[J];生命的化学;2004年06期
2 王菊萍,王莹,霍艳英,郭蔼光,张开泰;基于smad7基因为靶序列的RNA干涉作用研究[J];内蒙古农业大学学报(自然科学版);2004年04期
3 燕春艳;RNA干扰技术研究进展[J];实用医药杂志;2003年09期
4 赵洪波,张嘉宁;RNA干扰技术的应用[J];大连医科大学学报;2003年04期
5 孟和,陈学辉,潘玉春;RNA干扰用siRNA的体外转录合成[J];上海交通大学学报(农业科学版);2004年01期
6 范怡敏,耿飞,吴兴中;RNAi的机制及RNAi技术的应用[J];医学综述;2004年04期
7 张琴,赵胜,何凯;RNA干扰的研究现状与展望[J];黄牛杂志;2004年05期
8 周幼芬,陈建伟,范挽亭,张昊昊,廖继东,胡海燕;RNA干扰技术及其应用[J];现代临床医学生物工程学杂志;2004年05期
9 ;RNA干扰研究前沿和应用领域[J];生命科学仪器;2004年02期
10 陈竞;RNAi的研究进展[J];川北医学院学报;2004年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 邓清华;刘国文;刘磊;王建国;朱晓岩;李小兵;王哲;;siRNA特异性抑制犊牛原代肝细胞SREBP-1c基因的表达[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(上册)[C];2011年
2 季爱民;苏丹;车鸥;李文适;孙靓;张忠义;杨彬;;壳聚糖/siRNA纳米粒介导的功能性基因沉默研究(英文)[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
3 黄伟;吕明;金明姬;杨长青;高钟镐;;mPEG-PCL-g-PEI聚合物的合成及其siRNA递送性能[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
4 陈宇;郑海涛;杨力建;陈少华;沈琦;刘思初;李萡;李扬秋;;靶向抑制PPP2R5C基因的siRNA的筛选[A];第13届全国实验血液学会议论文摘要[C];2011年
5 秦照玲;赵平;赵兰娟;戚中田;;小干扰RNA能抑制SARS-CoV Spike蛋白的表达[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
6 刘政;邱广斌;;MYCT-1基因特异的siRNA对GES-1细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
7 陈卫华;王跃闽;;Cb1-b特异性siRNA载体的筛选验证[A];华东六省一市泌尿外科学术年会暨2011年浙江省泌尿外科、男科学学术年会论文汇编[C];2011年
8 刘芳蕾;周勇;应可净;;肺癌PLK1基因多态性及siRNA干预的研究[A];2011年第三十三届浙江省呼吸系病学术年会暨呼吸疾病诊治新进展学习班论文汇编[C];2011年
9 薛利军;曹明媚;秦照玲;潘欣;戚中田;;siRNA抑制结核分枝杆菌侵袭相关基因mcela在体外培养的人细胞内的表达[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年
10 章如新;;P物质siRNA在变应性鼻炎中的作用机制研究[A];世界中联耳鼻喉口腔专业委员会换届大会及第三次学术年会暨中华中医药学会耳鼻喉科分会第十七次学术交流会暨广东省中医及中西医结合学会耳鼻喉科学术交流会论文汇编[C];2011年
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1 余志平;打开功能基因组学与未来治疗学的大门[N];中国医药报;2004年
2 庄北宁;防治非典,专家称找到基因“新药”[N];新华每日电讯;2005年
3 杨霞;防治SARS药研发获阶段性成果[N];中国医药报;2004年
4 聂翠蓉编译;RNAi:生物技术的蓝月亮[N];科技日报;2003年
5 曾崇君;奇尔根核酸业务试水MBO[N];医药经济报;2004年
6 本报特约撰稿人 陆志城;RNA干扰技术遭遇“缺陷危机”[N];医药经济报;2003年
7 记者 毛黎;美开发出癌症治疗新技术[N];科技日报;2009年
8 张荔子;乳腺癌基因特异性药物曙光初现[N];健康报;2004年
9 杨霞;广东SARS防治药物研究取得阶段成果[N];中国医药报;2004年
10 倪永华;让基因保持沉默[N];科技日报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 胡平方;纤溶酶原激活物抑制剂-1 siRNA治疗实验性肝纤维化[D];第二军医大学;2010年
2 蔡磊;携带Survivin特异性siRNA的完全人源性肝癌单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白对肝癌凋亡的影响研究[D];第四军医大学;2010年
3 张伟;H5N1亚型高致病性禽流感病毒siRNA靶向制剂的研究[D];中国协和医科大学;2010年
4 郭炬;siRNA靶向沉默HPA基因对人膀胱癌BIU-87细胞的生物学及HPA相关基因的影响[D];华中科技大学;2011年
5 徐向上;Aptamer-protamine-siRNA复合物在肿瘤靶向治疗中的作用研究[D];华中科技大学;2010年
6 韩璐;豆科植物蒺藜苜蓿发育相关基因[D];山东大学;2010年
7 王哲文;后发性白内障的发病机制研究[D];吉林大学;2006年
8 向飞宇;心衰的机制与干细胞治疗基础研究[D];复旦大学;2009年
9 张彦萍;纤溶酶原激活物抑制剂-1siRNA抗博来霉素诱导的大鼠肺纤维化作用及机制[D];河北医科大学;2011年
10 万黎;Galectin-3特异性siRNA对肺癌肿瘤干细胞生物学功能影响的研究[D];华中科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郑亚婷;应用siRNA技术抑制铜绿假单胞菌外膜蛋白OprM表达的研究[D];昆明医学院;2010年
2 贾丽洁;ICP27特异性siRNA抑制HSV-1病毒复制的实验研究[D];郑州大学;2010年
3 付振宇;siRNA沉默HIF-1α基因对人前列腺癌PC3细胞生物学性状的影响[D];苏州大学;2010年
4 韦德芳;利用pSOS-HUS系统筛选靶向乙肝病毒X基因的siRNA的研究[D];重庆医科大学;2010年
5 马婧薇;ASGPR介导的靶向siRNA抑制HBV的复制与表达[D];华中科技大学;2009年
6 方首镕;siRNA干扰MDR1逆转舌癌耐药性表型的实验研究[D];广西医科大学;2011年
7 李杰;抑制PKM2的siRNA协同抑制CCND1的作用机制研究[D];安徽医科大学;2011年
8 王涵;应用siRNA技术下调Survivin抑制鼻咽癌细胞生长的研究[D];昆明医学院;2010年
9 索涛莉;靶向Hsp90β siRNA对Jurkat细胞生长抑制及化疗敏感性影响的研究[D];重庆医科大学;2010年
10 汤容;siRNA抑制人卵巢癌SW626细胞CXCR4基因的研究[D];重庆医科大学;2010年
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