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《河北农业大学》 2011年
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CIAV M突变株致病性试验及其在DF-1上生长适应性的研究

孙丹丹  
【摘要】:鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus, CIAV)为鸡传染性贫血病(Chicken infectious anemia, CIA)的病原,属圆环病毒科(Circoviridae),为单股、负义、共价结合的环状DNA。CIAV基因组只产生一个具有多顺反子特性的转录子。转录子上有三个AUG密码子,使其内部形成三个开放阅读框架(Open reading frames,ORFs),其中ORF3(366bp)位于OFR2(651bp)内,ORF2与ORF1(1350bp)部分重叠。ORFs分别编码VP3(13kD)、VP2(24kD)和VPl(52kD)三种病毒蛋白。VP1为结构蛋白,是中和抗原位点的组成部分;VP2为VP1的伴侣蛋白或骨架蛋白,与VP1在宿主细胞内共同诱发机体产生中和抗体;VP3是CIAV的主要致病性蛋白,可诱导细胞凋亡。北京市农林科学院高新技术实验室夏永恒等人采用PCR定点突变技术使编码CIAV VP3的起始密码子后移了39位,造成VP3的不完全表达,成功构建了pTCAVm阳性克隆株并初次获得了感染性克隆。本试验将从重组阳性克隆株开始,继续研究CIAV M突变体的致病性和其对DF-1细胞系的嗜性,为寻找更好的研制CIA减毒活疫苗的方案奠定基础。 本试验选取保存于-80℃的pTCAVm阳性克隆株,按照夏永恒等人将突变株体外环化的试验方法,重新复壮pTCAVm重组菌株,提取重组质粒,酶切鉴定后,使CIAV突变基因自身环化。用脂质体转染方法,将自身环化突变株转染到MDCC-MSB1宿主细胞内,并采用IFA及RT-PCR方法进行转染细胞内病毒复制情况的检测及CIAV序列测定,试验结果证明本试验同样获得了具有感染性的突变株-CIAV M突变株。用人工腹腔注射方法,将CIAV M突变株毒液接种于1日龄SPF鸡,并动态追踪CIAV M突变株在SPF鸡体内的致病性及在SPF鸡体内传代一次后对宿主细胞的致病性。用IFA方法,测得的CIAV M突变株的TCID_(50)值为10~(4.5)/mL;通过临床剖检变化及病理切片方法观察到:7、14、21日龄时,CIAV M突变株能够引起SPF鸡增重缓慢,胸腺等免疫器官内T淋巴细胞消失、组织萎缩,鸡腿骨骨髓颜色变为黄粉色,红细胞容积值显著下降等CIA的特征性病变;体内CIAV抗体水平检测结果显示:抗体水平表现为弱阳性,提示CIAV M突变株具有抗原性;采用流式细胞术测定感染的宿主细胞生长周期及细胞凋亡情况,试验结果显示:回归动物试验后的CIAV M突变株对MDCC-MSB1宿主细胞周期无明显阻滞作用,但其具有致宿主细胞凋亡作用。通过与CUX-1标准毒株的同行比较,整个试验结果显示:CIAV M突变株具有感染性,但其致病性明显减弱。 CIAV在MDCC-MSB1宿主细胞的病毒滴度较低,不利于CIAV的疫苗生产,因此本试验还试探性的将CIAV M突变株接种于DF-1细胞系中,为CIAV M突变株寻找一种新的生长细胞系。将CIAV M突变株接种于DF-1细胞系,经过5-7天的培养,六个重复组没有全部出现纤维细胞拉网、变圆等细胞病变;再次传代时,采用盲传方法,接种毒液为上一代细胞反复冻融获得的或直接从细胞板刮取的,经过5-7天的培养,六个重复组仍然没有全部出现细胞病变。CIAV M突变株通过接种于DF-1细胞系,传代15次,用PCR方法检测每代收取的细胞液,并利用IFA和RT-PCR方法验证PCR检测结果为阳性的样品,但后两种方法均未检测出阳性样品中的CIAV。根据整个试验结果推断:CIAV M突变株不能在DF-1上适应性生长,其可能不具有特殊的DF-1细胞系嗜性。
【学位授予单位】:河北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:S858.31

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【参考文献】
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