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山羊Agouti基因5’UTR变异及ASIP蛋白表达定位研究

吴伟伟  
【摘要】:山羊皮肤组织中Agouti基因非翻译区的变异可能与该基因的表达存在某种特定关系,进而影响被毛颜色的变化;同时,启动子区变异对启动子活性的影响可能直接对基因表达产生影响,而Agouti基因在皮肤组织表达部位的不同可能会引起黑色素分布的不同,进而引起被毛颜色的表型变异,因此这些关键科学问题的研究是解决山羊被毛颜色分子遗传机制的重要途径。 根据本试验室前期所测山羊Agouti基因部分序列(EF587236.2)和GenBank上已发表的绵羊Agouti基因序列(EU185099)进行引物设计,选择济宁青山羊(JNG)、辽宁绒山羊(LN)、雷州黑山羊(LZ)各30只,南疆黄羊快长系(NJF)32只,染色体步移方法扩增山羊Agouti基因5’UTR区,总扩增片段长度为7357bp,已提交到GenBank,序列号为JN651404。利用DNAMAN软件将JN651404与EF587236.2进行拼接,拼接序列长度为12847bp。再利用Spidey软件和绵羊mRNA (NM_001134303.1)对所获得的12847bp进行外显子、内含子预测,确定了JN651404包括90bp的外显子1和7267bp的5’UTR,并确定了山羊Agouti基因翻译起始位点A位点为7679位点。在此基础上,利用Neural Network Promoter Prediction启动子在线分析软件和TFSEARCH软件预测出山羊Agouti基因的一个候选启动子区--- 6450-7100bp。 对启动子区进行群体测序分析后得到三个突变位点,根据拼接结果命名这些突变位点,分别为g.C6474T,g.C6579T和g.T6703A。经群体遗传学分析后得出g.C6474T位点的CC基因型,g.C6579T位点的CC基因型以及g.T6703A位点的TT基因型与山羊黑色表型相关。三个突变位点之间存在连锁不平衡关系,且CCT单倍型为JNG,LZ,LN和NJF四个山羊品种的最原始单倍型,此单倍型也与山羊黑色被毛表型有关。 选用2只白色太行山羊,1只黑色太行山羊腹部皮肤组织,通过RACE试验对山羊mRNA进行测序研究,得到了一88bp长度的片段,由于在进行BLAST时此片段并不位于绵羊、猪等的5’UTR区,加上Agouti基因的外显子1在不同生物中存在很多剪接体类型,也没有前人对山羊的5’UTR区进行过研究,所以不能断定此片段是否就是山羊Agouti基因5’UTR的一部分 分别选用5只白色,5只黑色和5只棕色太行山羊腹部皮肤组织,进行山羊群体Agouti基因mRNA转录定量研究,结果表明Agouti基因mRNA在不同皮毛颜色山羊皮肤组织中转录量为:白色(0.8131±0.0577)棕色(0.5571±0.0736)黑色(0.3991±0.0289)。而在Agouti基因表达蛋白ASIP的定位研究(分别选用了3只白色,黑色,棕色太行山羊)中发现:在白色、黑色和棕色山羊皮肤组织的表皮、真皮中ASIP均没有表达;在黑色与棕色山羊皮肤组织毛囊外根鞘有大量表达,但在白色山羊皮肤组织毛囊组织中没有发现ASIP阳性信号。


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