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黄金梨果实ACC合成酶基因的克隆与表达分析

孙雯  
【摘要】:黄金梨(Pyrus pyrifolia‘Whangkeumbae’),属砂梨系统,品质优良,为我国主栽品种之一。但是,其果实不耐贮藏,采摘后在常温贮存或冷藏条件下易失水、腐烂、黑心,从而失去商品价值,并伴随产生许多其他问题。因此若能在黄金梨果实成熟阶段通过调控对果实成熟产生影响的因子,进而延缓果实衰老,对提高其耐贮性,延长货架期具有一定意义。 本试验以黄金梨(Pyrus pyrifolia‘Whangkeumbae’)不同成熟期果实为试验材料,克隆得到黄金梨果实ACC合成酶基因序列,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR的方法,检测了ACC合成酶基因在不同成熟期黄金梨果实中的相对表达量变化,从分子水平进一步对乙烯合成过程进行研究,为接下来的遗传转化奠定基础,更好的对乙烯合成过程进行调控。从而达到延长黄金梨贮藏期,货架期的目的。主要研究结果如下: 1、针对黄金梨果实富含水分,多酚多糖等次生代谢物质的特点,比较TAKARA plant tissue法、TIANGEN RNA plant plus Reagent法、改良3%CTAB法这三种方法在的优缺点,依据具体情况进行适当调整,最终确定以TIANGEN RNA plant plus Reagent法作为黄金梨果实总RNA的提取方法。该方法提取效果好,可有效去除多酚多糖等物质的干扰且总RNA质量较高。 2、根据已发表的早生新水中获得的ACC合成酶基因设计引物,对黄金梨果实中的ACC合成酶基因进行克隆,通过生物信息学分析发现该基因与GenBank中已登录的西洋梨、白梨的同源性均达到99%,与蔷薇科其他植物的同源性也达到了85%以上,有较强的保守性,对于同一科属间基因的克隆有参考价值。 3、通过荧光定量PCR技术,检测了ACC合成酶基因在不同成熟期的黄金梨果实中的表达量,在果实成熟前,该基因表达量逐渐增加,增幅缓慢,但在花后150 d时,该基因的表达量迅速升高并达到最高,随后又急剧下降。


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