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我国苹果主产区潜隐性病毒侵染特征研究

陈红霞  
【摘要】:苹果病毒病是对果树危害最大、影响最广的一种世界性病害。果树感染病毒后,一般树体生长量减少,产量降低,果实品质下降,不耐贮藏,严重时树体生长急剧衰退至枯死。在尚无有效的药剂防治和治疗措施情况下,繁殖无病毒苗木、实施果园无毒化栽培是防治苹果病毒病的最有效措施。国外诸多发达国家早在20世纪60年代已经开始发展无病毒化栽培,目前已基本普及。而我国对苹果病毒病研究起步较晚,无毒化栽培推广缓慢。正确认识病毒病的危害,准确掌握目前苹果病毒病的发生情况是制定和推广无毒化栽培政策的基础。近年来我国苹果病毒病的调查鉴定和研究工作相对薄弱,一些参考数据相对较老或者不全,因此对全国进行病毒危害现状调查对推进我国无毒化栽培有重要意义。本研究以建立高效、简化、准确率高、适合大规模样品的检测为目标对苹果病毒的RT-PCR反应体系进行优化,并通过对病毒时空分布规律的研究筛选最佳检测部位和取样时间,在此基础上对我国三个苹果主产区的病毒侵染状况做全面调查。主要结果如下: 1.苹果潜隐性病毒检测体系的优化在三种潜隐性病毒的常规两步单重RT-PCR检测体系基础上,对检测效率更高的多重RT-PCR检测体系进行了优化。 (1)对ASPV的引物进行了重新设计,筛选出了最佳的引物对组合。 (2)对两步多重RT-PCR检测体系进行了优化。优化后的RT体系中的ES Reaction Mix和EasyScript RT/RI Enzyme Mix包含了反应所需的主要试剂,只需加入适量总RNA即可。使操作步骤简化,工作效率提高,而且减少了人为出错和污染的几率,更加减少了误差。再者,PCR扩增过程使用含Taq酶的ES MIX,不仅包括了扩增过程所需要的除引物和反转录产物外的所有试剂,而且含溴酚蓝染料。PCR扩增完成后,产物直接上样电泳,节省了上样时间,使得操作步骤简化,检测效率提高。 (3)优化的一步多重RT-PCR检测体系使用新型试剂盒,该试剂已将RT和PCR反应所需的Buffer、Mg2+、dNTP、反转录酶、RNA酶抑制剂和Taq酶等按比例配成两种缓冲液Mix。反应体系配制时,只需按说明加入适量已含溴酚蓝染料Mix、总RNA模板和引物即可用于反应,扩增完成直接上样电泳。这比传统的RT-PCR方法操作步骤更简单,大大降低了污染几率和误差,同时节省了上样时间,使得检测过程更省时,工作效率更高。另外,对生产上危害较重的苹果锈果类病毒和苹果花叶病毒的RT-PCR反应体系进行了优化,建立了操作步骤更简单、效率更高的RT-PCR检测体系。 2.ASPV和ACLSV在树体内的时空分布规律采用荧光定量RT-PCR技术,对2010年4月到12月采集的枝条顶端、枝皮组织和根皮组织,用苹果肌动蛋白mRNA序列引物作为内参,以4月份枝皮组织的表达量作为标准,进行相对表达差异分析,结果显示: (1)ASPV在枝皮组织中的含量呈先降低再升高再降低的趋势,即6月份的含量最低,8月份稍有增高,10月份达到5个采集时期的最高值,12月份略有下降,最高含量约是最低含量的5.5倍;ASPV在枝条顶端的含量呈现先降低后升高的趋势,即6月份含量最低,8月份略增,10月份继续升高,12月份达最高值,最高含量约是最低含量的3.0倍;ASPV在根皮中的分布规律为先升高再降低,即4月份含量最低,8月份含量增加,12月份略有下降,最高含量约是最低含量的2.3倍。 (2)ACLSV在树体内的时空分布规律与ASPV基本相似,仅枝条顶端的含量变化略有不同,即ACLSV在10月份的增量小于ASPV,且此时含量低于12月份。 3.苹果潜隐性病毒在我国苹果主产区的分布特征通过对我国8个苹果主产省,50个果园的2144个样品分析结果表明: (1)采样果园均不同程度地受到苹果潜隐性病毒的侵染,果园病毒侵染率达100%,危害情况较严重。 (2)三种苹果潜隐性病毒(ASGV、ACLSV、ASPV)的整体发生率分别为:94.80%、59.33%、64.72%;总体混合侵染率为59.05%。相对而言,ASGV的侵染率最高,ACLSV的侵染率最低。 (3)三种苹果潜隐性病毒在不同品种间的侵染也有一定差异。三大主栽品种富士、红星、嘎拉的病毒侵染率都较高,ASGV的侵染率最高几乎都为100%;ASPV和ACLSV的侵染率相对最低。部分品种如金冠、乔纳金、秦冠等的病毒侵染率也较高,一些砧木品种和地方品种的染毒情况较低。 (4)在地区分布上,陕西省和河北省受三种苹果潜隐性病毒侵染较严重,复合侵染率也较高;其他地区ASGV侵染率较高,但ASPV和ACLSV的侵染相对较轻。


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