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《河北农业大学》 2012年
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农杆菌介导的枣树遗传转化研究

郝征  
【摘要】:枣树(Ziziphus jujuba Mill.)是我国原产重要果树。枣树由于花小、人工去雄难、坐果率低且胚败育现象严重,使得其杂交育种非常困难。枣疯病是由植原体引起致死性传染病害,几乎分布于国内外所有枣区,绝大多数枣树品种都对其敏感,已成为制约枣产业发展的严重障碍。随着生物技术的不断发展,基因工程已成为现代植物改良育种的有效手段。本研究旨在探索建立农杆菌介导的枣树遗传转化体系,并利用发根农杆菌提高枣树对枣疯病的抗性,为枣树遗传改良和枣疯病防治提供技术支撑。主要研究结果如下: 1.建立了冬枣的花药再生体系。诱导花药愈伤的适宜培养基为1/2MS+1.0mg/L 2,4-D+20g/L麦芽糖+5.5g/L琼脂;花药愈伤的适宜增殖培养基为MS+0.4mg/L TDZ+0.1mg/L NAA +20g/L麦芽糖+5.5g/L琼脂;1.0mg/L TDZ和0.4mg/L NAA的组合是诱导冬枣花药愈伤出芽的适宜生长调节剂组合,诱导出芽率达100%,平均出芽数为3.9个/块;0.2mg/L BA、0.1mg/L IBA和1.5g/L PVA是玻璃苗恢复的适宜组合,玻璃苗恢复率为48.9%;在添加1.5mg/L IAA的生根培养基中,生根率最高(43.3%),根长最长(4.2cm)。 2.首次建立了月光枣的花药再生体系。诱导花药愈伤的适宜培养基为1/2MS+1.0mg/L 2,4-D+20g/L麦芽糖+5.5g/L琼脂;月光花药愈伤的适宜增殖培养基为MS+0.6mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+20g/L麦芽糖+5.5g/L琼脂。适宜月光愈伤分化出芽的培养基为:MS+5.5g/L琼脂+20g/L麦芽糖+0.8mg/L TDZ+4.0mg/L AgNO3。其诱导出芽率为100%,平均出芽数为10.4个/块;在培养基MS+5.5g/L琼脂+30g/L蔗糖+0.2mg/L BA+0.1mg/L IBA+1.5g/L PVA中玻璃苗可恢复成正常苗;添加2.0mg/L IBA的生根培养基中月光生根率最高;GA3的添加对于枣愈伤的生长和玻璃苗的恢复均为抑制作用。 3.建立了根癌农杆菌介导的冬枣叶片遗传转化体系。适宜的遗传转化条件为:根癌农杆菌的OD600为0.8,侵染20min后,在共培养基MS+5.5g/L琼脂+20g/L麦芽糖+1.0mg/L TDZ+0.1mg/L IBA+200μM AS(pH5.8)中暗培养3d。首次将双抗虫基因(Bt基因和蛋白抑制剂基因API)转入冬枣中,得到了8个转基因株系。 4.建立了冬枣叶片及冬枣疯组培苗的发根农杆菌介导的遗传转化体系。冬枣叶片诱导毛根的适宜条件是在菌液浓度OD600为0.8时侵染叶片20min,在共培养基1/2MS+4.0mg/L IBA+5.5g/L琼脂+30g/L蔗糖(pH5.8)中暗培养3-5d,然后转接入培养基1/2MS0+CRO100mg/L中,光照条件为光照/黑暗为14/10h。冬枣疯组培苗茎段诱导出毛根的适宜条件为:在菌液中添加50μM的AS预活化1~2h,OD600为0.8侵染5~10min,共培养5d,共培养基为MS+5.5g/L琼脂+20g/L蔗糖+100mg/L CRO,光照条件为光照/黑暗为14/10h。首次通过发根农杆菌侵染使冬枣疯组培苗转化为正常植株,得到了30个抗病性提高的转健苗株系。
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