食品中三种致病菌多重PCR检测体系的建立及初步应用

【摘要】：近年来,全球食品安全恶性事件频发,食品安全问题是影响公共健康的重要因素,已经成为社会关注的热点。其中,细菌性食物中毒是导致各种食品安全恶性事件的主要原因。因此,食源性致病微生物的检测是食品卫生安全检测中一个重要的部分。目前,食源性致病微生物主要采用分离、培养然后生化鉴定的方法,操作繁琐,检测时间较长,通常需要3-5 d才能完成,且每次只能检出一种致病菌,灵敏度较低。因此,建立快速、高效、准确的食源性致病菌检测方法迫在眉睫。近年来,PCR技术发展十分迅速。多重PCR技术可以实现在一个反应管中同时对多种致病微生物的检测,具有高效、低成本、高灵敏度等优点。因此,本研究建立了食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的多重PCR检测技术。 本文根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nuc)、沙门氏菌的侵染上皮细胞表面蛋白基因(invA)和蜡样芽胞杆菌的溶血素基因(hblA)设计了3对特异性引物,进行多重PCR反应,可实现对三种致病菌的同时检测。试验过程中对反应体系中退火温度、Mg~(2+)、dNTP Mixture、Taq酶和反应循环数等影响因素进行优化,确定了最适多重PCR反应体系和循环参数。该反应体系为:2.5μL 10×PCR buffer,2.0μL MgSO_4,2.0μL dNTP Mixture,上游引物各1μL,下游引物各1μL,0.5μL Taq酶(5 U),三种致病菌DNA模板各2.0μL,加ddH2O至25μL。循环参数:采用冷启动,94°C预变性5 min;94°C变性40 s,59°C退火40 s,72°C延伸40 s,30个循环;72°C终延伸10 min。 在此条件下,检测了22株菌,4株金黄色葡萄球菌、4株沙门氏菌和4株蜡样芽胞杆菌均为阳性结果,而其它10株菌均为阴性结果。将三种致病菌随机组合,均能被检出。将多重PCR扩增产物胶回收进行核苷酸测序,将测序结果网上BLAST,证实扩增产物与已知序列的同源性均达到99%,因而该多重PCR反应特异性强。 本研究用该方法直接检测纯菌液,普通热裂解法提取DNA模板,金黄色葡萄球菌的灵敏度为10~3 CFU/mL,沙门氏菌的灵敏度为10~4 CFU/mL,蜡样芽胞杆菌的灵敏度为10~3 CFU/mL;同时检出三种致病菌的灵敏度达到10~4 CFU/mL。本研究采用五种不同方法从样品中提取三种致病菌DNA模板进行多重PCR反应,比较DNA模板提取方法的优劣。结果显示,采用溶剂提取热裂解法提取DNA模板效果好,操作较简便,且价格较低廉。该多重PCR反应检测人工污染纯牛奶,采用溶剂提取热裂解法提取DNA模板,金黄色葡萄球菌检出限为10~2 CFU/mL,沙门氏菌检出限为104 CFU/mL,蜡样芽胞杆菌检出限为10~2 CFU/mL,同时检出三种致病菌的检出限达到104 CFU/mL。 对市场上购买的50份样品进行检测,并与国标方法对比,多重PCR方法检测样品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的敏感性均为100%;特异性:金黄色葡萄球菌93.5%、沙门氏菌94.7%、蜡样芽胞杆菌90.6%;符合率分别为96%、92%、94%。 本研究成功建立了多重PCR法检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的反应体系。该方法具有特异性强、灵敏度高、检出限低、检测速度快和操作简便等优点。该法初步应用于实际样品的检测,整个过程在6 h以内即可完成。因此,该多重PCR检测方法具有一定的实际推广价值,对及时检出食源性致病菌,减少食源性致病菌引起的食物中毒,保障我国国民饮食安全具有重要的意义。